《Frontiers in Toxicology》：Tissue-specific mutagenicity of N-nitroso-methylphenylamine assayed by the transgenic rodent assay and duplex sequencing
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N-亚硝基甲基苯胺（NMPA）是一种大鼠食管致癌物，已在食品、烟草和药品中发现。本研究按照OECD TG 488指南推荐的方法，通过饮水将NMPA给予Big Blue转基因大鼠28天；苯并[a]芘（B[a]P）作为阳性对照给药。收集食管、肝脏和骨髓，分别使用c
N-亚硝基甲基苯胺（NMPA）是一种大鼠食管致癌物，已在食品、烟草和药品中发现。本研究按照OECD TG 488指南推荐的方法，通过饮水将NMPA给予Big Blue转基因大鼠28天；苯并[a]芘（B[a]P）作为阳性对照给药。收集食管、肝脏和骨髓，分别使用cII突变试验和双链测序（Duplex Sequencing, DS）进行突变分析。NMPA处理诱导了组织特异性突变，其中食管在cII和DS两种检测中均表现出最高的致突变反应，肝脏次之；骨髓相对不受影响，cII试验未显示增加，DS分析仅显示轻微升高。NMPA的DS突变谱特征为所有碱基替换类型及所有三核苷酸背景下均呈现广泛分布的升高，这与其他小分子亚硝胺相区别。值得注意的是，DS检测到的NMPA致突变性倍数增加高于转基因啮齿动物（TGR）试验，食管基因组突变频率最大增加7.5倍，而cII基因最大增加5.6倍。这些数据表明NMPA是一种器官特异性致突变物，其致突变效力与其在主要靶组织及其他组织中的致癌性相对应。
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一、研究背景与科学问题
亚硝胺类化合物（nitrosamines）是由亚硝酸盐与胺类在酸性或高温条件下反应形成的一类化合物，广泛存在于食品、烟草制品和药品等消费品中。小分子亚硝胺是已知最有效且作用最广泛的致癌物之一，仅有18%的亚硝胺被归类为非致癌性。亚硝胺的致突变性与致癌性之间存在强相关性，提示其致癌作用主要源于致突变性。然而，大多数亚硝胺需要经细胞色素P450酶（CYPs）代谢活化才能发挥致癌效应。尽管细菌系统中的致突变性与动物致癌性之间存在总体定性相关性，但少数致癌性亚硝胺在标准细菌试验中表现出微弱或无效的致突变作用。
自2018年药品中检出N-亚硝基二甲胺（NDMA）和N-亚硝基二乙胺（NDEA）以来，亚硝胺杂质引发了重大的监管和公共卫生关注，导致药品召回和全球更严格的法规要求。除少数特征明确的亚硝胺（如NDMA和NDEA）外，许多结构多样且具有潜在危害的亚硝胺的毒性尚未得到充分研究。NMPA即属于研究较少的亚硝胺，它是一种非挥发性、高亲脂性的亚硝胺，存在于食品中并已在药品中检出。NMPA经CYPs通过α-羟化代谢，产生甲醛和苯重氮离子（BDI）——一种可形成DNA加合物的活性中间体。然而，关于这些加合物的形成、稳定性、修复及体内致突变潜力的数据有限。
既往研究发现NMPA主要在大鼠食管诱导肿瘤，在咽部和前胃也有肿瘤形成，在小鼠中则见于肺。其靶器官特异性似乎与给药途径无关，通过饮水、腹腔注射或口服灌胃暴露均可观察到致癌效应。NMPA的TD50值（0.335 mg/kg/day，CPDB数据库）仅略高于NDMA（0.0959 mg/kg/day），后者是关注队列（Cohort of Concern）亚硝胺药物杂质的代表。近期研究表明，NMPA在使用大鼠肝S9的Ames试验中表现为弱效或无效应，但使用仓鼠肝S9时结果为阳性。
在现行监管建议下，短期遗传毒性试验被用于帮助识别化学致癌物。标准试验如Ames试验和体外哺乳动物细胞基因突变试验虽能提供有价值的遗传效应信息，但对于需要代谢活化的化合物（如亚硝胺），其预测体内致癌结局的能力有限。因此，体内试验如转基因啮齿动物（TGR）基因突变试验被用于提供更具生理相关性的数据。然而，TGR试验目前执行能力受限，且劳动力和资源密集。双链测序（DS）作为一种错误校正型下一代测序技术，能够检测基因组DNA中的低频突变，可应用于转基因或非转基因动物的任何组织，仅需少量基因组DNA，同时提供详细的突变谱，为致突变机制提供见解。
NMPA的致突变性、强致癌性、组织特异性和异常代谢行为对监管毒理学提出了重要问题。本研究旨在通过TGR试验和DS的并排比较，评估NMPA在多个组织中的致突变反应，并探讨组织选择对亚硝胺致突变性评估的影响。
二、研究设计与技术方法
研究人员选用6周龄雄性Big Blue转基因大鼠（来源：Gentronix，英国Alderley Edge），通过饮水给予NMPA 28天，目标剂量为0、5、10和20 mg/kg体重/天，剂量基于既往肿瘤发生研究确定。阳性对照组通过口服灌胃给予75 mg/kg/天B[a]P（溶于橄榄油）。阴性对照组和每个NMPA剂量组各6只大鼠，B[a]P组3只大鼠。末次处理后3天处死动物，收集全骨髓、肝脏和食管组织，液氮速冻后保存于?80 °C。
主要技术方法包括：（1）转基因cII基因突变试验：从组织中提取基因组DNA，回收含cII报告基因的λ穿梭载体，包装为感染性λ噬菌体颗粒，感染Escherichia coli G1250，分别在选择性（24 °C）和非选择性（37 °C）条件下培养，计算突变频率，每样本至少评估3 × 105个噬菌斑形成单位；（2）双链测序（DS）：使用TwinStrand DuplexSeq试剂盒构建文库，采用大鼠致突变检测panel（覆盖18条染色体上20个基因组区域，共48 kb，包含基因区/非基因区、编码区/非编码区及不同GC含量背景），在Illumina NovaSeq 6000平台进行2 × 150 bp双端测序，每个样本约1.8 × 108条reads，经TwinStrand DuplexSeq Mutagenesis App（DNAnexus平台v4.2.0）进行UMI分组、双链一致性判定、变异检测，每个样本双链碱基数约9亿，满足5000万的最低阈值要求。
三、研究结果
3.1 动物体重
所有动物在治疗期间均增重，但NMPA和B[a]P处理组的体重增长持续低于溶剂对照组。治疗结束时及处死当日（治疗后3天），所有处理组体重较对照组显著降低约10%–15%。无死亡或严重临床症状，本研究最高剂量低于最大耐受剂量（MTD），所有剂量均适合纳入致突变性评估。
3.2 cII基因突变频率
在肝脏和食管中均观察到NMPA诱导的突变，但两个组织均未见明确的剂量-反应关系。食管在所有组织中表现出最大的突变频率增加：0、5、10和20 mg/kg NMPA及B[a]P组的cII突变频率分别为22.2、103.1、125、94.8和57.8 × 10?6，三个NMPA剂量分别产生4.7、5.6和4.3倍增加，B[a]P产生2.6倍增加。肝脏中突变频率分别为25.8、40.5、44.3、49.8和255.7 × 10?6，NMPA组为1.6、1.7和1.9倍增加，B[a]P为9.9倍增加。骨髓未显示对NMPA的明显致突变反应，突变频率为26.6、30.6、27.8和44.6 × 10?6（1.1、1.0和1.7倍增加），而B[a]P在骨髓中产生4.3倍增加。
3.3 基因组DNA突变频率
DS分析显示食管在NMPA处理组中基因组突变频率增加最高：5、10和20 mg/kg组的突变频率分别为48.78、49.45和45.35 × 10?8，对照组为6.55 × 10?8，对应7.4、7.5和6.9倍增加。B[a]P在食管中增加最小（15.14 × 10?8，2.3倍）。肝脏中NMPA组突变频率为11.14、16.77和17.19 × 10?8（1.6、2.4和2.4倍），B[a]P组为37.98 × 10?8（5.4倍）。骨髓变化最小：NMPA组为9.21、9.48和8.7 × 10?8（1.5、1.6和1.4倍），B[a]P组为39.67 × 10?8（6.6倍）。
3.4 突变谱
NMPA处理后食管中观察到显著的突变频率增加，六种碱基替换类型（T → A、T → C、T → G和C → G等）均显著升高，突变谱与对照组显著不同（p < 0.0001）。与其他小分子亚硝胺（如NDEA主要诱导A:T → T:A颠换和A:T → G:C转换，占突变总数65%以上）不同，NMPA诱导六种碱基替换类型相对均匀的增加，三核苷酸背景下无主导模式。B[a]P在食管中仅显示轻微的C → A颠换增加，突变谱与对照组无显著差异（p = 0.41）。
肝脏中NMPA处理后突变较少，突变谱与对照组差异最小（p > 0.05）。B[a]P在肝脏中诱导最大的C → A颠换增加，尤其在CCA → CAA、CCC → CAC和CCG → CAG三核苷酸背景下（p < 0.05）。
骨髓中NMPA处理导致突变频率增加不足2倍，突变谱与对照组无显著差异（p > 0.1）。B[a]P在骨髓中以C → A颠换为主，GCG → GAG和CCG → CAG为最常见三核苷酸背景，同时观察到显著的C → G颠换增加，主要在CCG → CGG、ACG → AGG和GCG → GGG背景下（p < 0.01）。
与对照组相比，所有NMPA处理组和组织的20个靶区域突变频率均显著升高（p < 0.05），食管增加最显著，骨髓变化最小。与既往NEIPA研究相比，20个基因组位点间的突变频率变异明显更小，基因区与非基因区之间无一致差异。
余弦相似性分析显示，最高剂量NMPA组（Group 4）食管三核苷酸谱与COSMIC SBS3（同源重组修复缺陷预测标志）最相似；中剂量（Group 3）和高剂量（Group 4）组还与SBS87、SBS40和SBS9高度匹配。
四、讨论与结论
本研究表明NMPA具有组织特异性致突变性，食管为主要靶组织。食管对NMPA致突变的敏感性显著高于肝脏和骨髓，这可能与以下因素有关：经饮水给药时食管直接暴露于高浓度NMPA；食管含有特异性同工酶（如大鼠CYP2A3），能高效脱烷基化不对称亚硝胺；NMPA大部分绕过肝脏首过代谢而循环至食管黏膜局部活化；食管解毒能力有限，活性中间体BDI清除率低；食管缺乏肝脏中强效的烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶（AGT）修复机制。肝脏中NMPA诱导的突变仅来自A:T位点，而食管涉及所有六种碱基替换类型，与AGT修复差异一致。
DS在检测NMPA诱导致突变性方面表现出比TGR试验更高的灵敏度：食管中DS检测到7.4、7.5和6.9倍增加，而cII试验为4.7、5.6和4.3倍；肝脏中DS检测到1.6至2.4倍增加，cII试验为1.6至1.9倍；骨髓中cII试验无显著增加（1.0–1.7倍），而DS检测到显著增加（1.4–1.6倍）。
NMPA属于CPCA（致癌效力分类方法）PC2类别，预期为中等效力致癌物，PC2药物杂质的可接受摄入量（AI）限值为100 ng/day，与NDMA（96 ng/day）和NDEA（26.5 ng/day）的AI限值相比，NMPA的致癌效力几乎与NDMA和NDEA相当。
本研究的致突变性结果与致癌性数据一致：食管突变负荷最高，肿瘤发生率也最高（17/20大鼠）；肝脏突变增加小至中等，肿瘤发生率低（1/20）；骨髓致突变变化最小，无肿瘤发生（0/48）。这一组织特异性的对应关系提示，当致突变数据用于定量设定AI限值时，由于癌症靶组织未知，突变分析的组织选择必须经过科学论证。
本研究结论为：NMPA是一种组织特异性致突变物，食管为主要靶组织。cII转基因试验和DS均检测到食管突变频率的显著增加。NMPA处理导致所有类型碱基替换的增加。食管中癌症相关突变特征的存在进一步支持NMPA在食管组织中的强致癌潜力。这种组织特异性可能源于NMPA的特定化学结构、局部暴露、低肝脏首过代谢、食管特异性代谢活化以及食管低DNA修复能力。此外，研究结果凸显了DS检测细微致突变反应的能力，以及在亚硝胺致突变性检测中科学论证组织选择的必要性，特别是当评估仅局限于肝脏时。
