《Frontiers in Endocrinology》：GnRH antagonist-induced ovarian suppression does not protect the ovarian reserve from cyclophosphamide chemotherapy in tumour-bearing mice
编辑推荐：
**摘要**
**背景：** 促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）类似物在临床中被用于在化疗期间诱导卵巢抑制，并被认为可以保护卵巢免受化疗诱导的损伤，但其有效性和潜在机制仍不确定。尽管大多数临床前和临
**摘要**
**背景：** 促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）类似物在临床中被用于在化疗期间诱导卵巢抑制，并被认为可以保护卵巢免受化疗诱导的损伤，但其有效性和潜在机制仍不确定。尽管大多数临床前和临床研究聚焦于GnRH激动剂，但对GnRH拮抗剂在此情境下作用的研究却少得多，尽管后者能更快速、直接地抑制促性腺激素信号传导。
**材料与方法：** 研究人员使用GnRH拮抗剂地加瑞克（degarelix）在同源肿瘤移植（orthotopic tumour-bearing）小鼠模型中诱导卵巢抑制。随后评估了地加瑞克在生殖幼龄和老龄小鼠接受单次或两次化疗剂量时，是否能够保护卵巢免受环磷酰胺（cyclophosphamide）诱导的损伤。卵巢功能通过量化卵巢体积、黄体（corpora lutea）数量（排卵标志物）及血清抗缪勒管激素（anti-Müllerian hormone, AMH）水平进行评估，同时进行了卵泡计数和卵巢纤维化的组织学评估。
**结果：** 地加瑞克抑制了排卵活性，表现为黄体数量减少和卵巢体积缩小。然而，在单次剂量环磷酰胺处理的年轻小鼠中，地加瑞克与卵巢纤维化增加相关，并且在两个年龄组中均未能保护单次或两次环磷酰胺剂量后的卵巢储备。此外，地加瑞克未能阻止循环AMH水平的降低，所有治疗组在年轻小鼠中均显示出与对照组相比AMH水平降低。
**结论：** 综上所述，研究人员的发现不支持GnRH拮抗剂治疗对环磷酰胺诱导的卵巢损伤具有保护作用的观点。
**GnRH拮抗剂地加瑞克在肿瘤携带小鼠中对环磷酰胺诱导卵巢损伤的保护作用评估：一项临床前研究解读**
**一、研究背景与现存问题**
随着癌症检测和治疗技术的进步，青少年和年轻成人癌症患者的生存率持续提高，这使得长期生活质量，包括生育能力和内分泌健康，日益受到关注。化疗诱导的卵巢毒性，尤其是卵巢储备的耗竭，会显著增加早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency, POI）的风险，该病症定义为40岁之前卵巢储备耗竭和规律卵巢功能丧失，同时也增加早绝经的风险。这些影响不仅关乎未来的生育需求，还产生涉及整体健康的连锁后果，包括心血管疾病、骨质疏松症和神经系统疾病风险增加。因此，在维持抗肿瘤疗效的同时减轻卵巢损伤的策略成为该领域的重要优先方向。
卵巢储备是在胚胎期建立的，代表女性一生中不可再生的卵母细胞供应。保护构成卵巢储备的原始卵泡对维持生殖潜力和激素产生至关重要。然而，卵巢储备的原位量化并不可行，因为现有技术需要对整个卵巢进行组织学分析。临床上，血清抗缪勒管激素（anti-Müllerian hormone, AMH）广泛用作卵巢储备的间接标志物，但AMH由生长中窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞产生，而非静止的原始卵泡池，因此属于间接指标。临床前动物模型对于量化化疗后的卵巢储备保护效果不可或缺。
烷化剂如环磷酰胺是应用最广泛且卵巢毒性最强的化疗药物之一。环磷酰胺形成DNA交联和DNA双链断裂，最终触发细胞死亡。它可直接损伤原始卵泡的卵母细胞，导致卵巢储备耗竭，也可能损害颗粒细胞和膜细胞的存活，导致生长卵泡丢失并可能加速原始卵泡激活。除直接的卵泡丢失外，环磷酰胺还诱导卵巢纤维化，这与卵巢功能受损相关。
现有的女性生育力保存方案，包括卵母细胞、胚胎和卵巢组织冷冻保存，具有侵入性、耗时，且对需要紧急治疗的患者可能不可行。这些方法虽已改变生育力保存格局，但并不能预防治疗诱导的POI。因此，可与化疗同时给予以减少卵巢损伤的药理学辅助治疗引起了极大关注。促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）类似物，包括激动剂和拮抗剂，可与化疗同时使用以潜在减轻卵巢损伤。GnRH激动剂已被用作成熟生育力保存策略（如卵母细胞和胚胎冷冻保存）的非侵入性、可逆的药理学辅助手段，但不被视为替代方案。临床试验和荟萃分析报告了GnRH类似物联合治疗后POI风险降低和妊娠率提高，特别是在激素受体阴性乳腺癌患者中。然而，其解读受限于使用月经恢复作为替代终点，以及不同癌种间结果不一致。临床前研究结果也不一致。
GnRH类似物作用于垂体GnRH受体以抑制促性腺激素分泌。GnRH激动剂诱导初始短暂的促性腺激素“突发性释放”（flare），随后持续抑制，而GnRH拮抗剂则产生快速抑制且无突发期。通过诱导低雌激素状态，GnRH类似物治疗常伴随更年期样不良反应，如潮热、头痛、阴道干涩和情绪变化。
基于青春期前化疗时POI严重程度较低的观察，GnRH类似物治疗被认为模拟了青春期前的激素环境，即促性腺激素向卵巢的信号传导减弱。已提出多种机制解释GnRH类似物的潜在保护作用，包括减少FSH信号传导以限制卵泡激活及随后的卵巢储备耗竭，以及减少化疗期间卵巢灌注。然而，支持这些机制的临床和实验证据仍不一致，且机制研究有限。多项啮齿动物研究报道GnRH类似物未能保护卵巢储备免受环磷酰胺或顺铂损伤，而其他研究则报告GnRH类似物联合治疗后卵泡数量或AMH得以保留。促性腺激素抑制是否能在化疗期间保护卵巢仍未确定。
尽管GnRH激动剂在临床生育力保存中更常用，但GnRH拮抗剂如地加瑞克（degarelix）可提供快速、可逆的促性腺激素抑制，因此非常适合需要及时内分泌调节的肿瘤携带实验模型。与激动剂相比，GnRH拮抗剂在卵巢保护研究中受到的关注明显较少。此外，有限的临床前证据对拮抗剂相关的潜在卵巢毒性提出担忧。例如，西曲瑞克（cetrorelix）在无化疗情况下可耗竭大鼠和小鼠的卵巢储备。在本研究中，研究人员使用地加瑞克模拟急性促性腺激素抑制，在临床相关的肿瘤携带小鼠模型中直接研究GnRH通路抑制对化疗期间卵巢功能的影响。
**二、研究设计与技术方法**
研究人员将6周龄（生殖幼龄）和6月龄（生殖老龄）雌性C57BL/6J小鼠原位接种AT3-OVA细胞至第四乳腺脂肪垫。肿瘤达到约30 mm3后，小鼠随机分为治疗组，接受100 mg/kg环磷酰胺（腹腔注射）、78 mg/kg地加瑞克（皮下注射）或生理盐水对照。两次剂量方案中，第二剂环磷酰胺于一周后给予。当肿瘤体积达到预定组织采集终点（1100–1500 mm3）时收集卵巢和血清。主要技术方法包括：卵巢组织学分析（周期性酸-Schiff染色、全卵巢连续切片用于卵泡计数和黄体计数）、卵巢体积估计（基于Cavalieri原理的体视学方法）、天狼星红染色评估卵巢纤维化，以及血清AMH酶联免疫吸附测定。统计学分析采用GraphPad Prism软件，依据数据分布特性选用单因素方差分析（one-way ANOVA）、Brown-Forsythe和Welch ANOVA或Kruskal-Wallis检验。
**三、主要研究结果**
**3.1 Effects of degarelix on corpora lutea number and ovarian volume（地加瑞克对黄体数量和卵巢体积的影响）**
在肿瘤携带小鼠中，地加瑞克单独或与环磷酰胺联合治疗导致黄体完全缺失（年轻小鼠p=0.02和p=0.03；老龄小鼠p=0.06和p=0.06），证实了有效的促性腺激素抑制和排卵阻断。卵巢体积在地加瑞克治疗组中显著减少，年轻小鼠减少62%（p=0.009），老龄小鼠减少74%（p=0.03）。与环磷酰胺单独治疗相比，两次剂量环磷酰胺联合地加瑞克组的卵巢体积在年轻和老龄小鼠中分别显著减少68%和79%（p=0.001和p<0.0001）。组织学观察发现地加瑞克治疗组和联合治疗组的基质细胞呈现萎缩外观，核和细胞质深染。
**3.2 Assessments of ovarian fibrosis following degarelix and cyclophosphamide treatment（地加瑞克和环磷酰胺治疗后的卵巢纤维化评估）**
在年轻肿瘤携带小鼠中，地加瑞克联合单次剂量环磷酰胺组的卵巢纤维化显著高于对照组和环磷酰胺单独治疗组（p=0.03）。髓质区域分析显示，年轻小鼠中联合治疗组的纤维化高于对照组（p=0.03）。在两次剂量环磷酰胺队列中，年轻小鼠环磷酰胺单独治疗组的髓质纤维化高于对照组（p=0.05），但各组间全卵巢纤维化无显著差异。老龄小鼠中未观察到治疗组间的纤维化差异。
**3.3 Impacts of cyclophosphamide with or without degarelix on primordial and primary follicle numbers（环磷酰胺联用或不联用地加瑞克对原始和初级卵泡数量的影响）**
与对照组相比，单次剂量环磷酰胺使年轻和老龄肿瘤携带小鼠的原始卵泡数量分别显著耗竭62%（p=0.02）和89%（p=0.002）。地加瑞克联合环磷酰胺治疗组的小鼠原始卵泡数量也低于对照组（p=0.01和p=0.03），且与环磷酰胺单独治疗组无差异。两次剂量环磷酰胺后，年轻小鼠原始卵泡数量较对照组显著减少（p=0.05），联合治疗组的减少程度与环磷酰胺单独治疗相似（p=0.05）。单次剂量环磷酰胺使老龄小鼠初级卵泡数量较对照组减少85%（p<0.0001），地加瑞克单独（p=0.005）及联合治疗（p=0.001）组同样低于对照组。两次剂量环磷酰胺使老龄小鼠初级卵泡减少56%（p=0.02），联合治疗在年轻（p=0.02）和老龄（p=0.006）小鼠中均导致初级卵泡数量低于对照组。
**3.4 Serum AMH concentrations following single-dose treatment（单次剂量治疗后的血清AMH浓度）**
在年轻单次剂量环磷酰胺队列中，与对照组相比，环磷酰胺单独治疗使AMH水平显著降低54%（p=0.005），地加瑞克单独治疗降低50%（p=0.005），联合治疗降低71%（p=0.0005）。地加瑞克未能阻止环磷酰胺诱导的血清AMH降低。
**3.5 Impacts of cyclophosphamide with or without degarelix on secondary and antral follicle numbers（环磷酰胺联用或不联用地加瑞克对次级和窦卵泡数量的影响）**
在老龄肿瘤携带小鼠中，单次和两次剂量环磷酰胺分别使次级卵泡数量较对照组减少72%（p=0.02）和46%（p=0.02），联合治疗组也表现出类似的耗竭（p=0.04和p=0.0007）。年轻小鼠中次级卵泡无显著变化。单次剂量环磷酰胺队列中各组窦卵泡数量无差异。两次剂量后，年轻小鼠地加瑞克单独治疗（p=0.0002）和联合治疗（p=0.01）组窦卵泡数量低于对照组；老龄小鼠联合治疗组窦卵泡数量低于对照组（p=0.03）和环磷酰胺单独治疗组（p=0.02）。
**3.6 Growing follicle atresia following treatment（治疗后的生长卵泡闭锁）**
单次剂量环磷酰胺队列中，各治疗组及年龄组的闭锁卵泡比例相似。在两次剂量环磷酰胺队列中，年轻小鼠中地加瑞克联合两次剂量环磷酰胺组的闭锁卵泡比例显著高于对照组（p=0.02）和环磷酰胺单独治疗组（p=0.009）。老龄小鼠中未观察到显著差异。
**四、讨论与结论**
本研究表明，GnRH拮抗剂地加瑞克可有效抑制肿瘤携带小鼠的排卵活性和卵巢体积，但未能保护卵巢储备免受环磷酰胺诱导的耗竭。地加瑞克联合治疗不仅未能在两个年龄组和两种化疗方案中维持原始卵泡、初级卵泡和血清AMH水平，还在年轻小鼠中与增加的卵巢纤维化、生长卵泡闭锁和窦卵泡减少相关。这些发现与部分既往研究一致，表明GnRH类似物不能可靠地保护卵巢储备免受环磷酰胺和顺铂损伤。值得注意的是，一些既往使用GnRH激动剂（如戈舍瑞林，goserelin）的保护性结果可能受肿瘤类型差异或实验设计缺陷影响，因为在雌激素受体阳性MCF-7肿瘤模型中，GnRH类似物可能通过直接抗肿瘤增殖效应间接影响卵巢结局。
研究人员指出，原始卵泡的维持和激活不依赖促性腺激素，这从机制上解释了卵巢抑制无法保护卵巢储备的原因。GnRH拮抗剂在给药后数小时内即可显著抑制促性腺激素，而GnRH激动剂需约14天才能达到垂体抑制，但即使如此，拮抗剂诱导的抑制在环磷酰胺给药时可能尚未完全建立，且环磷酰胺诱导卵巢损伤极为迅速，这可能限制了保护效果。此外，地加瑞克单独治疗在年轻小鼠中即引起AMH降低，与既往报道的西曲瑞克在无化疗情况下耗竭卵巢储备的研究相呼应，提示GnRH拮抗剂本身可能具有卵巢毒性。
研究人员承认本研究存在两项主要局限性：首先，肿瘤体积终点导致采集年龄存在变异性，且未考虑治疗组间肿瘤负担差异的潜在影响；其次，使用的卵巢抑制药物为GnRH拮抗剂地加瑞克，而临床上常用GnRH激动剂。未来研究需要在停药恢复后进行自然交配或体外受精评估功能性生殖结局，并探究基质改变的持久性。
**研究结论：** 地加瑞克诱导的卵巢抑制在生殖幼龄和老龄肿瘤携带小鼠中，无论采用单次还是两次给药方案，均未能保护卵巢储备免受环磷酰胺诱导的耗竭。联合治疗还与年轻小鼠卵巢纤维化和卵泡闭锁增加以及窦卵泡数量和血清AMH浓度降低相关。单独的卵巢抑制在该模型中不足以保护卵巢储备，且可能本身促进了卵巢损伤。这些发现强调，在将GnRH类似物的潜在卵巢保护作用外推至临床前，需在肿瘤携带模型中进行涵盖不同化疗方案和年龄组的进一步临床前研究，并结合生殖结局评估。
