高、低乳尿素浓度荷斯坦奶牛肾脏清除率、估计肾重吸收比及肾脏蛋白质组研究

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Renal clearance rate, estimated renal reabsorption ratio, and kidney proteome of Holstein dairy cows with divergent milk urea concentrations

　　

近期mRNA表达研究提出，多种肾脏蛋白参与电解质、氨基酸及带电化合物的排泄，以降低高乳尿素（HMU）浓度奶牛的尿素、尿酸和肌酐清除率。因此，本研究旨在分析高、低乳尿素浓度奶牛的单价离子、氨基酸和乳酸的肾脏清除率及肾脏蛋白质组。HMU奶牛血浆肌肽浓度较高，但肾脏肌肽清除率和转运体表达较低。HMU奶牛血浆瓜氨酸升高但精氨酸酶丰度降低，提示尿素解毒下调。通路分析显示蛋白酶体激活，以增加可能堵塞滤过屏障的蛋白质降解。然而，HMU奶牛降低的尿素、尿酸和肌酐清除率不能由其转运体表达降低解释，而可能与局部溶质改变（如肌肽处理）及相对肾脏重量较轻有关。

研究背景方面，畜牧生产与氮排放密切相关，粪尿来源的尿素可经脲酶快速转化为氨，影响土壤、水和空气质量。乳尿素氮（MUN）与日粮粗蛋白（CP）水平相关，可作为群体水平监测日粮CP适宜性的指标；但即使CP摄入相同，个体奶牛MUN仍存在差异，低MUN曾被提出作为降低尿氮排泄的育种预测指标。已有研究显示，高乳尿素氮（HMU）奶牛尿素、肌酸、肌酐和尿酸肾脏清除率较低或呈降低趋势，肾脏重量也较低，但总尿尿素和氮排泄在HMU与低乳尿素氮（LMU）奶牛间相近。因此，LMU并不必然对应更低尿氮排泄，其肾脏清除差异的生理和分子机制尚待阐明。肾脏在尿素、氨、肌酐、尿酸、电解质、游离氨基酸（FAA）和乳酸等水溶性含氮代谢物排泄与重吸收中起关键作用，但HMU与LMU奶牛电解质、FAA和乳酸的肾脏清除率及肾脏蛋白质组尚未系统比较。基于此，研究人员开展本研究，分析HMU与LMU荷斯坦奶牛Na⁺、Cl^?、FAA和乳酸的肾脏清除率与估计肾重吸收比，并分析肾皮质和髓质蛋白质组。研究结论认为，HMU与LMU奶牛Na⁺、Cl^?和乳酸清除率及重吸收比无差异，但HMU奶牛肾肌肽清除降低，与SLC15A2表达降低和血浆肌肽升高相关；HMU奶牛肾氨解毒、氨酰-tRNA生物合成和尿素循环降低，而蛋白酶体、内吞、活性氧、糖/丝氨酸/苏氨酸代谢、糖酵解和氧化磷酸化升高，提示蛋白合成降低但能量产生增加以支持蛋白酶体机制降解蛋白，推测用于防止滤过屏障堵塞；早先观察到的尿素、肌酐、尿酸或肌酸清除率差异不能归因于相应转运体表达差异，而可能归因于局部溶质处理改变和右肾相对重量较轻。该研究为理解奶牛肾脏清除与乳尿素浓度差异提供了蛋白质组学线索。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究以18头非妊娠、多胎次德国荷斯坦奶牛为对象，来源于梅克伦堡-前波美拉尼亚商业农场按产奶量和MUN筛选，2018年9月至2020年2月分九批次配对进入实验，HMU与LMU各9头，处于第二至第四泌乳期，产奶量可比。采集血浆和酸化尿液，检测电解质、肌酐、乳酸和FAA；按尿量和血浆浓度计算肾脏清除率（RCR）及估计肾重吸收比（RRR）；取肾皮质和髓质，经SDS-PAGE切胶、LC-MS/MS、Mascot/Scaffold鉴定，采用DESeq2、sPLS-DA和DAVID进行差异表达与功能富集分析。

研究结果如下。3.1 动物特征与乳成分：通过饲养试验与屠宰采样比较，发现体重、干物质和饮水量、产奶量、乳蛋白、乳脂、乳糖、体细胞数、能量校正乳（ECM）和脂蛋白比无差异；按设计LMU组乳尿素浓度低于HMU组，日乳尿素分泌量呈趋势降低；LMU右肾重量占体重比例较高，总肾重量占体重比例呈趋势较高。3.2 电解质、乳酸、肌酐和氨基酸浓度：通过血浆和尿液分析，发现血浆Na⁺、Cl^?、乳酸和肌酐无差异；HMU血浆瓜氨酸和肌肽显著较高；尿液中除谷氨酸在HMU呈趋势较低外，其他尿液氨基酸、pH、尿量、电解质、乳酸和肌酐无差异。3.3 肾脏清除率和重吸收比：通过计算RCR和RRR，发现电解质、乳酸、肌酐和FAA清除率无显著差异，HMU肌肽清除率呈趋势较低；电解质、肌酐、乳酸和FAA的估计肾重吸收比无差异。3.4 差异表达蛋白功能分类：通过肾皮质和髓质蛋白质组分析，鉴定6793个蛋白，清洗后保留4463个；sPLS-DA可区分两组蛋白表达；200个差异蛋白中LMU组80个上调、120个下调；火山图显示LMU中IGFBP7和ND1表达较高，而PGAM1、LOC113900017、SLC4A1、CTSC、ERAP1、CHMP5和EIF4E表达较低。3.5 功能富集分析：通过DAVID分析，LMU上调蛋白主要涉及二羧酸分解、苏氨酸-tRNA氨酰化、内体运输调节、谷氨酰胺和长链脂肪酸代谢；分子功能中苏氨酸/氨酰-tRNA连接酶和脂肪酰-CoA水解酶上调，二磷酸甘油酸变位酶、组蛋白脱乙酰酶和分子内磷酸转移酶下调；KEGG显示代谢、甲状腺激素信号和氨酰-tRNA生物合成在LMU上调，蛋白酶体、糖酵解/糖异生及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢下调；HMU中SLC7A8、SLC22A8、SLC12A9、SLC44A1、SLC2A2、SLC16A7和SLC15A2较低或呈趋势较低，SLC4A1和SLC25A1呈趋势较高。

讨论部分总结：原文围绕肾重量、清除率与重吸收、转运体和代谢变化展开。HMU总肾重/体重呈趋势较低，右肾显著较轻；但电解质、乳酸和蛋白源性氨基酸清除率无差异，仅肌肽清除率呈趋势降低，与血浆肌肽较高及SLC15A2较低相符，肌肽重吸收比未变。HMU血浆瓜氨酸较高、精氨酸酶丰度较低，尿谷氨酸呈趋势较低，谷氨酰胺代谢和尿素循环下调，提示肾脏氨解毒减弱。多种转运体表达差异未伴随相应血浆/尿液底物浓度或清除率差异，原文认为可能与肾内转运体分布异质性、补偿性转运体表达以及蛋白质组反映总蛋白而非膜定位活性有关。代谢通路方面，HMU氨酰-tRNA生物合成和尿素循环降低，蛋白酶体、内吞、活性氧、糖/丝氨酸/苏氨酸代谢、糖酵解和氧化磷酸化升高，提示蛋白合成降低而能量产生增加以支持蛋白酶体降解，原文假设该机制可能防止蛋白堵塞滤过屏障，但需功能研究验证。局限包括蛋白质组仅评估总蛋白丰度而非膜定位或酶/转运体/蛋白酶体活性，且每组动物数有限，存在II类错误风险且未进行多重检验校正。研究结论翻译：总之，高、低乳尿素浓度荷斯坦奶牛Na⁺、Cl^?和乳酸清除率或肾重吸收比无差异，但HMU奶牛肾肌肽清除降低，与肌肽转运体SLC15A2表达降低和血浆肌肽升高相关。尿谷氨酸呈趋势降低、谷氨酰胺和尿素代谢下调而血浆瓜氨酸升高，提示HMU奶牛肾细胞代谢的氨解毒减弱。肾氨酰-tRNA生物合成和尿素循环降低而蛋白酶体活性、内吞、活性氧、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、糖酵解和氧化磷酸化升高，表明蛋白合成降低但能量产生增加以支持蛋白酶体机制降解蛋白，推测用于防止肾滤过屏障堵塞。最后，早先观察到的尿素、肌酐、尿酸或肌酸清除率差异不能归因于相应转运体表达差异，而可能归因于局部溶质处理改变和右肾相对重量较轻。