脓肿分枝杆菌诱导囊性纤维化巨噬细胞免疫抑制的机制研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Mycobacterium abscessus induces immune suppression in cystic fibrosis macrophages

　　

引言：囊性纤维化（CF）患者高度易感由脓肿分枝杆菌（MAB）引起的慢性肺部感染，MAB是一种本质耐药的非结核分枝杆菌（NTM）。尽管CF中巨噬细胞功能障碍已获公认，但原代人巨噬细胞对MAB的应答仍鲜有定义。方法：研究人员利用来自CF患者和健康供者的外周血单核细胞及单核细胞来源巨噬细胞（MDM），探究了对MAB的固有免疫应答。巨噬细胞在低感染复数（MOI）下感染经调理的MAB光滑型（MAS）或粗糙型（MAR）分离株。去除胞外菌后，于感染后2小时和24小时评估胞内菌载量、氧化爆发、NOX2激活和细胞因子产生。结果：各组间MAB摄取相当，非CF巨噬细胞在24小时时胞内MAR与MAS无差异；相反，CF巨噬细胞在24小时时胞内存活的MAR显著增多，该表型在非CF巨噬细胞中通过CFTR敲低得以重现。MAB感染的CF巨噬细胞表现出显著降低的氧化爆发和减弱的NOX2 p47_phox磷酸化。经CFTR抑制剂处理的非CF巨噬细胞模拟了减弱的氧化爆发。CF巨噬细胞还表现出改变的细胞因子应答，与健康巨噬细胞相比，IL-8显著升高而IL-1β降低。值得注意的是，MAR感染的CF巨噬细胞分泌的TNF-α显著少于非CF巨噬细胞，且与MAR感染的非CF巨噬细胞和MAS感染的CF巨噬细胞相比，凋亡显著减少。讨论：这些发现表明，CF巨噬细胞在控制毒性粗糙型MAB形态方面存在固有的功能缺陷，揭示了pwCF中持续性NTM感染的潜在机制，并强调了宿主导向治疗的必要性。

论文解读：脓肿分枝杆菌诱导囊性纤维化巨噬细胞免疫抑制

一、研究背景与目的

囊性纤维化（CF）由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起，导致多种细胞类型CFTR离子通道功能缺失。CFTR异常不仅影响气道上皮细胞，造成粘稠粘液积聚和细菌定植的微环境，还直接损害单核细胞和巨噬细胞的杀菌功能，加剧慢性肺部感染和过度炎症。近年来，非结核分枝杆菌（NTM）感染在全球范围内日益常见，而CF患者对其尤为易感，其NTM患病率较一般人群高出约1000倍。脓肿分枝杆菌（MAB）作为最难治疗的NTM之一，与慢性阻塞性肺疾病和CF等结构性肺病患者的持续感染密切相关，可导致不可逆的肺损伤、终末期支气管扩张和肺功能加速下降。MAB存在光滑型（MAS，高表达糖肽脂）和粗糙型（MAR，低表达糖肽脂）两种形态，其中MAR在临床上与更差的治疗结局相关。然而，原代人巨噬细胞对MAB形态型的应答尚未被系统研究。因此，本研究旨在利用CF患者和健康供者的外周血单核细胞及单核细胞来源巨噬细胞（MDM），探究CFTR功能障碍对MAB形态型早期感染的固有免疫应答影响。

二、研究内容与总体结论

研究人员从35例CF患者和25例健康对照者中分离外周血单核细胞，体外分化为巨噬细胞后，以低感染复数感染调理后的MAS或MAR。结果显示，CF巨噬细胞在感染后24小时胞内活MAR显著增多，而MAS与健康对照无差异；CRISPR/Cas9介导的CFTR敲低在THP-1巨噬细胞中重现了这一表型。CF巨噬细胞还表现出氧化爆发降低、NOX2 p47_phox磷酸化受损、IL-8升高而IL-1β降低、MAR感染时TNF-α分泌减少及凋亡显著下降。这些发现证明CF巨噬细胞在控制毒性粗糙型MAB方面存在固有缺陷，提示MAB可能利用类似结核分枝杆菌的免疫逃逸策略，为持续性NTM感染提供了机制解释，并支持在临床管理中考虑菌落形态学特征。

三、主要技术方法

研究人员使用的主要技术方法包括：从CF患者（平均年龄18.79岁，75.8%为F508del纯合）和健康对照者外周血中分离单核细胞，在含10%人AB血清的培养基中培养6天分化为MDM；利用MAB标准株19977的MAS和MAR同基因菌落变体，经人AB血清调理后以2.5：1的感染复数感染巨噬细胞，通过菌落形成单位（CFU）计数评估2小时和24小时的摄取与胞内活菌量；使用CRISPR/Cas9构建稳定表达Cas9和CFTR导向RNA的THP-1细胞系，实现CFTR敲低；用luminol化学发光法（单核细胞）和2',7'-二氯荧光素（DCF）荧光法（巨噬细胞）检测活性氧（ROS）产生；以免疫印迹检测NOX2亚基（p47_phox、p40_phox、gp91_phox）磷酸化及蛋白激酶C（PKC）异构体磷酸化；采用ELISA定量TNF-α、IL-8、IL-6、MIP-1β和IL-1β分泌；利用乳酸脱氢酶（LDH）释放试验和TUNEL试验分别评估细胞毒性及凋亡。

四、主要研究结果

1. 原代分化的人CF巨噬细胞在感染后24小时胞内MAR显著多于MAS

通过CFU计数，2小时时非CF和CF巨噬细胞对MAS或MAR的摄取无显著差异；但在24小时时，CF巨噬细胞较非CF巨噬细胞（p=0.027）和MAS感染的CF巨噬细胞（p=0.0007）含有显著更多的胞内活MAR。在THP-1巨噬细胞中，Cas9对照（CFTR^+/+）未显示MAS与MAR差异，而CFTR敲低（CFTR^-/-）巨噬细胞则重现了CF表型（p=0.0020），表明CFTR功能缺失是导致MAR存活增加的直接原因。

2. MAB变体对人血清杀菌作用具有抗性，且不引起巨噬细胞毒性差异

将MAS和MAR与不同浓度人AB血清孵育，发现人血清可使大肠杆菌活力下降99%以上，但对任一MAB形态型均无杀菌作用。LDH释放检测显示，未感染、MAS感染或MAR感染的CF与非CF巨噬细胞间细胞毒性无显著差异（p=0.8512），排除了细胞死亡对胞内活菌计数的影响。

3. MAB形态型诱导的活性氧产生在CF单核细胞和巨噬细胞中减弱

luminol和DCF实验显示，PMA刺激的非CF单核细胞产生显著ROS峰，而MAB感染显著抑制了ROS产生。未感染的CF单核细胞本身ROS即显著低于非CF（p=0.0174），MAB感染后进一步降低。在巨噬细胞中，MAR感染的CF巨噬细胞（p=0.0418）和CFTR抑制剂INH-172处理的MAR感染非CF巨噬细胞（p=0.0497）ROS显著减少，提示CFTR功能障碍直接损害氧化爆发能力。

4. CF巨噬细胞在MAB感染后NOX2 p47_phox磷酸化减少

免疫印迹显示，MAB感染后2小时CF巨噬细胞p47_phox磷酸化即有降低趋势，24小时时较非CF巨噬细胞显著减少（p=0.0199），而p40_phox、gp91_phox及PKC异构体磷酸化无显著差异。这表明NOX2组装中p47_phox磷酸化受损是CF巨噬细胞ROS产生缺陷的重要分子基础。

5. MAB感染改变了CF巨噬细胞的炎症细胞因子谱

ELISA结果显示，CF巨噬细胞感染MAB后IL-8分泌显著高于非CF巨噬细胞（p<0.0001）；MAS感染的CF巨噬细胞MIP-1β（p=0.0216）和IL-6（p=0.0289）升高，但MAR感染时无差异；MAR感染的CF巨噬细胞TNF-α显著减少（p=0.0072）；两种形态型感染的CF巨噬细胞IL-1β分泌均显著降低（p<0.0001）。免疫印迹未检出成熟IL-1β和cleaved caspase-1，提示MAB在转录后水平抑制IL-1β加工。TUNEL凋亡分析显示，MAR感染的CF巨噬细胞凋亡较MAR感染的非CF巨噬细胞（p=0.0321）及MAS感染的CF巨噬细胞（p=0.0127）均显著减少，提示TNF-α分泌不足可能削弱凋亡诱导，为MAR在CF巨噬细胞中持续存活创造了条件。

五、讨论与结论

讨论指出，CF巨噬细胞对MAR感染表现出一系列叠加性缺陷：杀菌能力受损、ROS产生减少、p47_phox磷酸化降低、TNF-α分泌减少以及凋亡下降，这些缺陷共同导致了对粗糙型MAB的易感性增加。研究人员强调，MAB表现出“隐匿型”胞内病原体的特征，其免疫逃逸策略与结核分枝杆菌相似。综上，本研究首次证明CFTR功能障碍在原发性人巨噬细胞中损害了MAB感染的功能应答，且粗糙型MAB感染引发的缺陷尤为显著，提示菌落形态学应成为pwCF中MAB感染临床管理的重要考量因素。该研究为开发宿主导向的免疫治疗策略、增强细菌清除并延缓肺功能下降提供了理论依据。