加热烟草气溶胶提取物与香烟烟雾提取物在人肺成纤维细胞中氧化与炎症反应的比较研究

《Frontiers in Physiology》：Comparative oxidative and inflammatory responses to heated tobacco aerosol and cigarette smoke extracts in human lung fibroblasts

　　

摘要 引言： 可燃性香烟烟雾可诱导肺细胞发生氧化应激和炎症反应。加热烟草产品（HTPs）被提出作为减少有毒物排放的替代品，但其细胞效应尚未完全阐明。 方法： 将人胚肺成纤维细胞MRC-5暴露于水溶性香烟烟雾提取物（CSE；0.1–1.0 puffs/mL）或加热烟草气溶胶提取物（HTE；活力测定为1.5–5.5 puffs/mL，其他终点为3.0–5.5 puffs/mL）。浓度锚定于各产品24小时半数抑制浓度（IC50）（CSE为0.70 puffs/mL，95% CI 0.63–0.77；HTE为4.76 puffs/mL，95% CI 4.39–5.16）。评估了细胞毒性、氧化敏感的二氢乙啶（DHE）荧光强度、细胞内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）水平以及细胞形态学变化。ATG5蛋白作为探索性终点纳入研究。 结果： 两种提取物均以浓度依赖方式增加DHE荧光强度及细胞内TNF-α和IL-6水平，同时伴随细胞活力下降和形态学改变。ATG5检测结果无定论，因所有处理浓度均未与未处理对照组产生显著差异。名义上的抽吸口数浓度不等同于等效剂量。在一项探索性比较中，在接近各自24小时IC50的浓度下（CSE 0.7 puffs/mL和HTE 4.75 puffs/mL），CSE诱导的DHE荧光增强幅度更大（相对于溶剂对照为3.17倍 vs. 2.31倍），并且细胞内IL-6和TNF-α信号也高于HTE。在90分钟和4小时时间点，两者未建立等效的细胞活力水平。 讨论： 在本研究特定条件下，在所选的比较浓度点上，HTE引发的氧化和炎症反应在数量上小于CSE。

研究背景与目的

香烟烟雾是肺部外源性活性氧（reactive oxygen species, ROS）的主要来源，可破坏细胞氧化还原平衡并诱发氧化应激，进而激活炎症信号通路，导致促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）和白介素-6（interleukin-6, IL-6）的表达升高。此外，氧化应激与自噬过程的调控有关，而自噬功能障碍被认为参与了慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）和肺纤维化等慢性肺病的发病机制。加热烟草产品（heated tobacco products, HTPs）作为一种不燃烧烟草的新型尼古丁递送系统，旨在减少燃烧产生的有害物质。已有研究表明，与传统香烟相比，HTPs的气溶胶中含有显著较低水平的羰基化合物、挥发性有机化合物（volatile organic compounds, VOCs）和颗粒物。然而，关于HTPs暴露后自噬相关过程的参与情况仍知之甚少。因此，本研究旨在比较香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract, CSE）和加热烟草气溶胶提取物（heated tobacco aerosol extract, HTE）对人胚肺成纤维细胞MRC-5的氧化和炎症反应的影响，并将ATG5蛋白水平作为探索性终点，以检验两种产物在其各自的标准化抽吸方案下是否都能诱导浓度依赖性的氧化和炎症反应，以及HTE需要更高的名义抽吸浓度才能达到相似效应。

研究方法

研究人员使用了以下关键技术方法：

1. 1.
   采用ISO 3308:2012标准方案（35 mL puff体积，2 s持续时间，60 s间隔）制备CSE，并依据ISO 20778:2018规定的加拿大卫生部深度（Health Canada Intense, HCI）方案（55 mL puff体积，2 s持续时间，30 s间隔）制备HTE。
2. 2.
   使用PrestoBlue?刃天青还原法测定24小时细胞活力，并通过非线性回归拟合计算半数抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）。
3. 3.
   利用二氢乙啶（dihydroethidium, DHE）荧光探针检测90分钟暴露后的细胞内氧化剂活性（作为ROS指标）。
4. 4.
   采用细胞内蛋白质印迹技术（In-Cell Western, ICW）定量分析4小时暴露后细胞内TNF-α、IL-6和ATG5蛋白的表达水平。
5. 5.
   通过相差显微镜观察10小时暴露后的细胞形态学变化。

研究结果

3.1 CSE和HTE暴露对MRC-5细胞毒性的比较分析

通过PrestoBlue?细胞活力测定发现，CSE和HTE均以浓度依赖性方式降低细胞活力。CSE从0.5 puffs/mL起显著降低活力，其IC₅₀为0.70 puffs/mL（95% CI 0.63–0.77）；HTE从3.5 puffs/mL起显著降低活力，其IC₅₀为4.76 puffs/mL（95% CI 4.39–5.16）。这表明HTE需要更高的名义抽吸浓度才能达到与CSE相当的细胞毒性水平。

3.2 CSE和HTE暴露后的形态学分析

相差显微镜观察显示，CSE处理组细胞出现进行性的结构变化，包括细胞收缩、变圆和脱落，且在较低名义浓度下即可观察到明显改变。相比之下，HTE处理组的形态学变化更为渐进，低浓度时细胞基本维持正常形态和贴壁状态，随着浓度升高才逐渐出现细胞质凝聚和细胞变圆。

3.3 CSE和HTE诱导的ROS产生评估

DHE荧光检测结果表明，两种提取物均以浓度依赖性方式增加细胞内氧化剂活性。CSE处理的DHE荧光强度从0.1 puffs/mL时的1.47倍上升至1.0 puffs/mL时的3.52倍；HTE则从3.0 puffs/mL时的1.77倍升至5.5 puffs/mL时的2.73倍。所有浓度的DHE信号均显著高于溶剂对照，且阳性对照抗霉素A（Antimycin A）验证了测定的有效性。

3.4 CSE和HTE引起的炎症细胞因子反应

ICW定量分析显示，两种提取物均以浓度依赖性方式增加细胞内TNF-α和IL-6的表达。对于TNF-α，CSE在所有测试浓度下均显著升高，HTE同样如此。对于IL-6，CSE从最低浓度0.1 puffs/mL起即显著升高，而HTE从4.0 puffs/mL起才达到统计学显著性。CSE引发这些炎症反应所需的名义浓度低于HTE。

3.5 CSE和HTE暴露后的ATG5蛋白表达

作为探索性终点，ATG5蛋白水平在任一产物的任何浓度下均未与未处理对照组产生显著差异。由于该实验板中的溶剂对照孔出现了异常的ATG5低信号，研究人员认为数据未提供ATG5蛋白增加的证据，并指出单一标志物不能推断自噬活性或通量。

3.6 在各产品自身24小时IC₅₀附近的探索性比较

鉴于两种产品的名义抽吸浓度不具备化学等效性，且浓度-反应曲线不平行，研究人员进行了探索性比较。在接近各产品自身24小时IC₅₀的浓度下（CSE 0.7 puffs/mL和HTE 4.75 puffs/mL），CSE诱导的DHE荧光、细胞内IL-6和TNF-α信号均显著大于HTE。

讨论与结论

本研究表明，CSE和HTE均能在MRC-5成纤维细胞中引起浓度依赖性的氧化和炎症反应，而ATG5蛋白未见明显变化。在响应的终点指标中，CSE在更低的名义抽吸浓度下即能诱发效应，并且在接近各自IC₅₀的探索性比较中，CSE引发了更强的反应。这些差异可部分归因于传统卷烟的高温燃烧（>800°C）产生大量有毒化合物，而HTPs在较低温度（<350°C）下工作，虽大幅减少了有害成分，但仍含有尼古丁和有毒羰基物种等生物活性物质。因此，HTPs虽然被认为是减害替代品，但不能视为无害。研究人员强调，由于缺乏化学表征、不同抽吸方案导致的非等效剂量以及培养基稀释度不匹配等局限性，这些发现应被视为在特定产品暴露条件下的初步观察结果，不能直接推断群体层面的风险。

研究结论翻译： 总之，当前研究结果表明，香烟烟雾提取物（CSE）和加热烟草气溶胶提取物（HTE）均能在人肺成纤维细胞中诱导可测量的细胞反应，表现为DHE相关（氧化剂）荧光增强、细胞内TNF-α和IL-6水平升高，同时伴有细胞活力下降和进行性形态学改变。在本研究条件下，CSE在较低的名义抽吸浓度下产生这些效应，并且在接近各产品24小时IC₅₀的探索性比较中，其效应强于HTE。ATG5蛋白水平在暴露于任一产物后均未与未处理对照组产生显著差异。在本研究的实验条件下，在所比较的浓度点上，加热烟草气溶胶提取物诱导的氧化和炎症反应小于香烟烟雾提取物；然而，两种产品间缺乏化学剂量等效性，这排除了任何关于群体层面风险的直接推论。这些结果应被视为在特定产品实验条件下获得的初步观察，需要通过基于化学锚定的暴露指标、分泌性介质的测量、基于通量的自噬评估以及更具生理相关性的暴露模型来加以确认。