SERPINA1相关SOX4–FN1上皮程序与侵袭性甲状腺乳头状癌淋巴管内皮应答的关联

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：A SERPINA1-associated SOX4–FN1 epithelial program linked to lymphatic endothelial responses in aggressive papillary thyroid carcinoma

　　

摘要专业翻译 背景： 淋巴结转移（LNM）使甲状腺乳头状癌（PTC）的风险评估和治疗规划复杂化。肿瘤上皮程序与淋巴微环境之间的关系尚不清楚。 方法： 研究人员整合了单细胞RNA测序和空间转录组学数据与批量队列，以表征上皮状态及其临床关联。批量队列来自癌症基因组图谱（TCGA）和基因表达综合数据库（GEO）。通过去卷积、通路、调控和细胞间通讯分析检验了上皮-淋巴关系；利用机器学习构建了一个LNM分类器。研究人员使用扰动和拯救实验、淋巴管内皮细胞（LEC）检测、异种移植瘤和人体组织分析验证了关键发现。 结果： 一个包含来自46例甲状腺标本的221,187个细胞的图谱鉴定出一个细胞外基质相关的THY5上皮状态。尽管其样本水平丰度在肿瘤组间无显著差异，但在侵袭性肿瘤的合并细胞中THY5富集。批量分析将更高的估计THY5丰度与不良临床病理特征和免疫排斥相关联。一个包含SERPINA1和FN1的探索性11基因分类器可区分淋巴结状态。在TCGA内部评估集中受试者工作特征曲线下面积（AUC）为0.810，在两个GEO队列中分别为0.768和0.800。通讯和空间分析暗示了FN1相关的上皮-淋巴相互作用以及局部THY5–LEC共定位。扰动实验支持SERPINA1、SOX4和FN1之间的功能关系。与单独敲低SERPINA1相比，SOX4重新表达增加了FN1 mRNA和蛋白水平。在SERPINA1耗竭的肿瘤细胞中重新表达FN1抵消了LEC标志物、管形成和迁移的减少。SERPINA1敲低还抑制了异种移植瘤生长并减少了FN1染色。 结论： 研究人员的发现支持PTC中SERPINA1相关SOX4–FN1表达、恶性上皮行为和LEC反应之间的功能联系，凸显了这一分子程序在研究上皮-淋巴相互作用方面的潜力。11基因LNM分类器在评估队列中可区分淋巴结状态，为分子指导的风险评估提供了一个探索性框架。

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一、研究背景与研究目的

甲状腺乳头状癌（PTC）是最常见的内分泌恶性肿瘤，通常预后良好。然而，部分肿瘤表现为局部浸润、区域淋巴结转移（LNM）或复发。颈部LNM在诊断时很常见，影响手术和监测决策，但其与局部区域复发的关联部分取决于淋巴结数量、大小和结外扩展。常规评估可能遗漏隐匿性淋巴结病变和微小转移灶，超声检查在小或解剖结构受限的淋巴结中也常不明确。PTC进展涉及上皮异质性和微环境重塑。单细胞和空间研究已在甲状腺癌中解析出多样的上皮状态、免疫区室、成纤维细胞程序和内皮细胞群体。然而，与免疫和基质重塑相比，上皮状态与淋巴重塑之间的关系研究较少。因此，LNM易发肿瘤中恶性上皮状态如何与淋巴管内皮细胞（LEC）相关联仍是一个悬而未决的问题。本研究旨在通过多组学整合与实验验证，阐明PTC中与LNM相关的上皮程序及其对LEC的影响。

二、研究方法概述

研究人员整合了公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学（ST）以及来自TCGA和GEO的批量转录组队列。利用BayesPrism进行批量去卷积分析，结合加权基因共表达网络分析（WGCNA）与差异表达筛选候选基因，并通过多种机器学习算法构建LNM预测模型。运用NicheNet和CellChat推断细胞间通讯，采用稳健细胞类型分解（RCTD）和ISCHIA进行空间组成聚类与共现分析。通过单细胞调控网络推理和聚类（SCENIC）以及虚拟扰动（scTenifoldKnk/scTenifoldOE）鉴定候选转录因子。体外实验中，在BCPAP和TPC-1细胞系中进行siRNA介导的基因敲低、质粒过表达及拯救实验，并通过共培养体系评估LEC的功能变化。体内实验采用BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型。

三、研究结果

3.1 单细胞图谱与PTC上皮亚群

研究人员整合四个公共scRNA-seq数据集，构建了包含221,187个细胞的甲状腺单细胞图谱，鉴定出七种主要细胞类型。重新聚类上皮细胞得到11个转录不同的亚群（THY1–THY11）。其中，THY5亚群在侵袭性肿瘤的合并细胞中富集，表现出较高的BRAF相关评分、中等分化水平和广泛的基因组不稳定性分布。Augur分析显示THY5在区分PTC N1与N0状态时排名第二（AUC = 0.771）。

3.2 THY5与侵袭性上皮状态的细胞外基质重塑程序

THY5的标志基因包括SERPINA1、HLA-DRA和CD74。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，THY5相关基因富集于抗原加工呈递、胶原含细胞外基质、细胞粘附等通路。Hallmark分析发现THY5上调基因显著富集于TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB。侵袭性肿瘤组差异表达基因同样富集于胶原含细胞外基质和细胞粘附分子相互作用。

3.3 轨迹分析将THY5与BRAF相关的低分化上皮状态关联

分区图抽象（PAGA）连接THY5与THY8，伪时间排序将THY5置于晚期区域。BRAF相关评分与伪时间正相关（R=0.73），而RAS相关评分和甲状腺分化评分（TDS）负相关。

3.4 批量转录组队列支持THY5的临床和微环境关联

在TCGA和GEO队列中，去卷积显示THY5估计丰度在肿瘤中更高，并与N1分期、更晚总体分期和T分期相关。THY5高表达组BRAF突变频率达85%，伴随更高的癌症相关成纤维细胞（CAF）、髓系来源抑制细胞（MDSC）和免疫排斥评分。

3.5 探索性11基因分类器区分淋巴结状态

通过整合WGCNA模块和差异表达，研究人员构建了包含SCEL、B3GNT3、FN1、CHI3L1、PLCD3、CST6、TIMP1、ADORA1、PRSS23、SERPINA1和CDH6的11基因分类器。Stepglm（后向）+ GBM模型在TCGA训练集AUC为0.856，内部评估集为0.810，两个外部GEO队列分别为0.768和0.800。

3.6 通讯分析提示THY5与LEC间的FN1相关相互作用

NicheNet分析以LEC为接收细胞，FN1被鉴定为候选配体。CellChat分析显示，在侵袭性肿瘤组中，THY5作为发送者与LEC之间存在显著的FN1–(ITGAV+ITGB1)和FN1–(ITGA5+ITGB1)相互作用，对应整合素αVβ1和α5β1。

3.7 空间转录组学揭示肿瘤中异质性细胞组成与细胞外基质通讯

对13张切片的空间转录组分析显示，FN1信号在所有PTC和局部晚期PTC（LPTC）样本的细胞外基质-受体类别中排名第一。Getis–Ord Gi分析识别出局部细胞外基质通讯热点区域。

3.8 THY5与LEC在选定肿瘤区域局部共现

MISTy邻域分析和ISCHIA共现分析表明，在多个组成簇（CC）中THY5与LEC的共检测超过随机期望，提示两者在局部空间环境中共同出现。

3.9 调控网络与虚拟扰动支持SOX4为FN1相关候选调控因子

SCENIC分析显示SOX4_387g调节子活性在THY5中高于正常样THY1和THY10。SOX4虚拟敲除和过表达均将FN1列为差异调控评分最高的前30个基因之一。SOX4与FN1在TCGA和GEO队列中表达正相关。

3.10 OGT与SERPINA1相关及O-GlcNAc和FN1丰度变化

免疫沉淀-质谱（IP-MS）鉴定出O-连接N-乙酰葡糖胺转移酶（OGT）为SERPINA1相关候选蛋白。外源和内源免疫共沉淀（co-IP）及邻近连接实验（PLA）证实SERPINA1与OGT及O-GlcNAc存在邻近信号。OGT敲低降低SERPINA1和FN1蛋白表达，而过表达则增加。

3.11 SOX4参与SERPINA1相关的FN1表达

SERPINA1敲低显著降低SOX4和FN1蛋白表达。SOX4敲低降低FN1水平，过表达则增加。染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）显示SOX4在FN1启动子区域富集。在SERPINA1敲低背景下，SOX4重新表达显著提高FN1 mRNA和蛋白水平。

3.12 FN1重新表达抵消SERPINA1敲低引起的LEC变化

肿瘤细胞SERPINA1敲低降低共培养LEC中FLT4、PROX1、总NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65蛋白水平，并减少管形成、Transwell迁移和伤口愈合。在此背景下FN1过表达显著逆转这些分子和功能指标。

3.13 异种移植瘤和人体组织分析支持SERPINA1和FN1的肿瘤相关作用

SERPINA1敲低的BCPAP和TPC-1异种移植瘤最大直径和重量显著减小，且免疫组化显示SERPINA1和FN1染色减弱。人体组织标本中肿瘤组织的SERPINA1和FN1染色强于相应非肿瘤组织。

四、结论与意义

本研究通过多组学整合与实验验证，揭示了PTC中一个SERPINA1相关的SOX4–FN1上皮程序与LEC应答之间的功能联系。该分子程序为研究上皮-淋巴相互作用提供了新的切入点。所构建的11基因LNM分类器在评估队列中展现出区分淋巴结状态的能力，为分子指导的风险评估提供了探索性框架。研究结论明确指出：研究人员的发现支持PTC中SERPINA1相关SOX4–FN1表达、恶性上皮行为和LEC反应之间的功能联系，凸显了这一分子程序在研究上皮-淋巴相互作用方面的潜力。