《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Endometrial microbiota in IVF patients: Lactobacillus dominance, pathogen prevalence and recurrence after treatment
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引言： 子宫内膜微生物群（endometrial microbiota）近年来被描述为以乳杆菌（Lactobacillus）为主导的环境，该菌属水平的降低与着床率和妊娠率的下降相关。此外，女性生殖道中包括细菌、真菌和病毒病原体在内的多种微生物的检出和过度生
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引言： 子宫内膜微生物群（endometrial microbiota）近年来被描述为以乳杆菌（Lactobacillus）为主导的环境，该菌属水平的降低与着床率和妊娠率的下降相关。此外，女性生殖道中包括细菌、真菌和病毒病原体在内的多种微生物的检出和过度生长，已被认为与流产或早产等妊娠并发症相关。然而，接受不孕症治疗患者的子宫内膜微生物群改变的患病率尚未得到充分描述。
方法： 通过实时定量PCR（Real-Time qPCR）对子宫内膜活检样本中36种与生殖结局相关的微生物（包括细菌、真菌和病毒）进行定量检测。此外，在86例患者接受个性化抗菌和/或益生菌治疗后进行了第二次活检，以评估治疗 efficacy。
结果： 在所分析的样本中，87.52%检测到微生物群改变。在菌群失调样本（Lactobacillus < 90%，p<0.01）中检测到显著较高的病原体存在。更具体而言，机会性细菌病原体与菌群失调的相关性更为频繁（p<0.0001）。Ureaplasma parvum 和 Gardnerella vaginalis 是最常检出的细菌病原体，无论是单独还是联合检出；而 Candida spp 和巨细胞病毒（Cytomegalovirus）分别在8.2%和1.6%的样本中检出。在接受个性化抗菌和益生菌治疗后进行第二次活检的患者中，观察到病原体存在显著减少（p<0.001），尽管 Ureaplasma parvum 在部分患者中表现出复发。
讨论： 研究结果表明，子宫内膜微生物群失衡在接受IVF治疗的患者中较为常见。识别这些失衡并予以相应治疗，可能有望改善这些患者的子宫内膜环境。
论文解读文章
一、研究背景与意义
近年来，子宫内膜微生物群在生殖结局中的重要性日益受到关注。与阴道微生物群类似，多项研究描述了乳杆菌（Lactobacillus）在子宫内膜中的优势地位，而其他细菌物种如加德纳菌（Gardnerella）、普雷沃菌（Prevotella）或阿托波菌（Atopobium）在生育力正常患者中也以较低比例存在。子宫内膜微生物群相较于阴道微生物群具有更低的生物量和更大的微生物多样性。高水平的乳杆菌通过产生乳酸和过氧化氢、调节局部环境并防止病原体定植，对生殖健康发挥促进作用；此外，乳杆菌代谢物可刺激抗菌肽和抗炎细胞因子的产生，为着床和妊娠创造有利环境。
然而，这一稳定的“乳杆菌主导子宫内膜”概念正日益受到质疑。一些研究认为，子宫内膜样本中经常报道的乳杆菌优势可能部分反映了样本采集过程中阴道乳杆菌的污染，而非真正的子宫内膜微生物特征。同样，其他聚焦于代谢活跃微生物的研究报道，乳杆菌在健康女性子宫内膜中并非占主导地位。由于不同研究发表结果的变异性，目前尚无法确定正常子宫内膜微生物组的准确定义。
尽管存在这种异质性，在IVF人群中，乳杆菌优势仍与改善的生殖结局相关。低于特定阈值（通常<90–80%）的乳杆菌丰度降低和微生物菌群失调已与较低的着床率、妊娠率和活产率以及增加的流产风险相关。与阴道病相关的机会性细菌过度生长也可能干扰着床过程和临床妊娠的实现。此外，子宫内膜中某些具有潜在致病性的微生物如脲原体（Ureaplasma）或支原体（Mycoplasma）的存在与不孕、着床失败、流产和更高的早产风险相关。
近期研究还强调了真菌和病毒对生殖道的影响。念珠菌（Candida）感染影响约75%的女性一生中至少一次，其中20%为无症状。病例报告提示宫内感染念珠菌属（albicans 和 glabrata）可能与较高的早产率和流产率相关。巨细胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）和单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus, HSV1和HSV2）等病毒也与不良妊娠结局和对胎儿的负面影响相关。CMV在备孕前感染的垂直传播率为5.5%且无新生儿影响，而围受孕期感染使传播率增至21%，胎儿受累增至28.8%，导致听力损失和小头畸形等状况。HSV1-2感染与流产、早产、先天性和新生儿疱疹风险增加相关。
本研究旨在确定不孕患者中不同子宫内膜微生物群谱的患病率，重点关注乳杆菌优势和病原体（细菌、真菌、病毒）的存在。此外，还分析了抗菌治疗对具有致病性谱且在治疗后进行第二次活检的患者子宫内膜微生物群组成的影响。
二、研究设计与主要技术方法
这是一项多中心研究，涉及2022年在58家IVF诊所接受治疗的1619例患者，这些患者接受了ES-META微生物组基因组检测的子宫内膜分析。纳入标准为年龄超过18岁，有既往着床失败史、不明原因流产、不明原因不孕、复发性阴道病和/或子宫内膜炎/子宫内膜异位症，以及既往自身免疫或炎症性疾病临床史。
子宫内膜活检样本由妇科医生使用标准程序采集，使用Pipelle导管从子宫底部提取约30 mg组织。采集过程中特别注意避免收集黏液组织或凝血块，并在导管插入前轻柔去除可见宫颈黏液和多余血液，避免接触阴道壁以尽量减少阴道污染风险。
子宫内膜微生物群分析采用微流控RT-PCR技术，使用Biomark X平台和TaqMan Fast Advanced Master Mix基因表达商业探针，对36种微生物进行检测，包括具有致病潜力的微生物，无论是机会性还是严格病原体。DNA提取使用ReliaPrep Blood gDNA Miniprep kit系统，并进行预扩增以提高灵敏度。阴性对照纳入DNA提取、预扩增和最终微流控PCR步骤以监测整个工作流程中的潜在污染。
三、主要研究结果
3.1 菌群正常/失调谱
根据乳杆菌相对丰度和具有致病潜力微生物（机会性或严格）的存在对检测结果进行分类。乳杆菌超过90%的样本被认为是菌群正常（乳杆菌主导），而较低百分比的样本被认为是菌群失调（非乳杆菌主导）。对所有患者进行的首次子宫内膜微生物群检测分析显示，大多数样本为菌群失调（83.26%），其中37.61%（609个样本）的乳杆菌相对丰度低于10%。菌群正常和失调组的乳杆菌相对丰度平均值分别为96.77% ± 2.95%和26.66% ± 28.83%。微生物组成与评估的变量（包括BMI和样本采集时的月经周期天数）之间未观察到统计学显著关联。
3.2 病原体存在情况
根据各种细菌、病毒、真菌和原虫的检出或过度生长情况，样本被分类为致病性或非致病性。至少一种病原体在33.17%的样本中被检出，其中大多数致病性样本为菌群失调（87.15%）。菌群失调样本的病原体比例显著高于菌群正常样本（p=0.003943）。在致病菌中，Ureaplasma parvum 和 Gardnerella vaginalis 检出频率最高。在菌群正常样本中，Ureaplasma parvum 是主要病原体，但与菌群失调样本相比无统计学显著差异（p=0.2112）；而 Gardnerella vaginalis 在菌群失调样本中更为常见（p<0.0001）。Candida spp 在8.2%的样本中检出，在菌群失调样本中显著更普遍（p=0.0194）。病毒（巨细胞病毒和单纯疱疹病毒1型）在1.7%的样本中检出，在菌群正常样本中更常见，但差异无统计学意义。部分样本含有多种病原体，最常见的组合包括 Ureaplasma parvum 与 Gardnerella vaginalis、Ureaplasma parvum 与 Candida spp，以及 Gardnerella vaginalis 与 Candida spp。菌群正常样本中严格病原体的 prevalence 较高，而菌群失调样本中机会性细菌的存在显著更高（p<0.0001）。
3.3 第二次活检
86例患者因微生物群结果改变在治疗后进行了第二次或第三次活检。平均活检间隔时间为79.35 ± 36.25天。在有两份活检样本的患者中，菌群正常和失调组的病原体百分比均显著下降（p<0.001）。在71例首次结果为致病性的患者中，治疗后54例（76.06%）第二次结果为非致病性，而17例（23.94%）仍显示病原体，其中8例保留了相同病原体（最常见为 Ureaplasma parvum，6例）。9例患者进行了第三次活检，其中4例在第三次样本中未检出病原体。值得注意的是，一名持续存在 Ureaplasma parvum 的患者两次使用多西环素治疗后，仅在其性伴侣接受治疗后该病原体才不再被检出。
3.4 不同患者组的微生物群
对着床失败（IF：1-2次失败胚胎移植）、反复着床失败（RIF：≥3次失败移植）和有既往流产史的患者进行比较，各组在菌群正常/失调率或致病性样本比例方面未发现显著差异。同样，检出的病原体类型和比例在这些组之间也没有差异。
四、讨论与结论
讨论部分指出，阴道微生物组成已被广泛研究，健康状态通常与乳杆菌主导环境相关。乳杆菌相对丰度降低，加上机会性细菌或真菌的过度生长以及某些病原体的存在，可导致细菌性阴道病、念珠菌病或阴道炎等状况。近期研究强调了乳杆菌主导子宫内膜环境的重要性，因为它与较高的着床率和持续妊娠率相关。此外，非乳杆菌主导的子宫内膜与促炎标志物水平升高相关，提示不良生殖结局。
本研究中使用的≥90%乳杆菌相对丰度阈值来定义子宫内膜菌群正常，是基于Moreno等人（2016）最初提出的标准，该标准将子宫内膜微生物群分类为乳杆菌主导（>90%）或非乳杆菌主导（<90%），并报道非乳杆菌主导患者有着显著较差的着床、临床妊娠、持续妊娠和活产结局。尽管已提出替代定义，包括≥80%的阈值，且一些研究质疑严格阈值的生物学有效性，但≥90%仍是科学文献中验证最广泛、应用最系统的阈值。
研究结果显示，大多数IVF患者具有菌群失调的子宫内膜环境，近一半患者的乳杆菌相对丰度低于10%。致病物种主要在菌群失调样本中观察到，Ureaplasma spp 和 Gardnerella vaginalis 是最常检出的，其次是 Candida spp。Ureaplasma spp 被认为是性传播微生物，与不孕、早产和新生儿发病相关，其定植生殖道的能力似乎独立于乳杆菌优势。Lactobacillus 物种已被描述通过释放多种分子产生针对机会性病原体过度生长的保护环境。
在治疗后进行第二次活检的患者中，大多数病例治疗后未检出病原体，乳杆菌相对丰度增加，导致菌群正常率提高和乳杆菌相对丰度极低（<10%）样本比例降低。然而，治疗持续时间和益生菌配方的变异性可能影响了这些结果。17例患者第二次活检中检出致病菌过度生长/存在，8例仍存在相同类型的病原体，提示可能的抗生素耐药或由于患者性伴侣缺乏干预而导致的再感染。持续存在的病原体最常见为 Ureaplasma parvum（6例），该微生物已知可对大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类抗生素产生耐药性。
结论部分指出，本文发现强调了在IVF诊所治疗的高比例患者存在失衡的子宫内膜微生物群，表现为某些病原体过度生长和/或乳杆菌物种相对丰度低。因此，评估子宫内膜微生物群（包括病原体存在）可能为具有特定生殖挑战的患者（如反复着床失败或流产）提供相关信息，因为这些失衡已在文献中与胚胎着床和妊娠并发症相关。此外，在抗菌或益生菌治疗后进行第二次活检的患者中发现了子宫内膜微生物群组成的差异，治疗后致病物种的存在显著降低。然而，需要使用未治疗组和生殖结局数据的进一步研究来评估菌群失调和/或致病性谱治疗的有效性，以及评估性伴侣的微生物群组成以避免可能性传播微生物的再感染。
