厄瓜多尔结核分枝杆菌RDRio基因型的分子流行病学追踪更新：2018年与2023年比较分析

《Frontiers in Public Health》：Molecular epidemiology of the RDRio genotype of Mycobacterium tuberculosis in Ecuador: a tracking update for the years 2018 and 2023

　　

引言： 结核分枝杆菌（MTB）的RDRio基因型是拉丁美洲-地中海（LAM）家族中的一个主要基因型，与传播性增强和耐多药（MDR）相关。在厄瓜多尔，一项先前的基线研究报告显示，在2012–2016年间，其流行率较低，为2.09%，这是在2015年以来来自委内瑞拉（该国RDRio高度流行）的大量移民涌入之前的数据。本研究旨在更新厄瓜多尔RDRio基因型的分子流行病学。 方法： 研究人员通过双重PCR筛选了2018年（384株）和2023年（315株）收集的699份临床MTB分离株中的RDRio基因型，并通过24位点MIRU-VNTR分型、spoligotyping和全基因组测序（WGS）对其进行了进一步表征。研究人员基于MIRU-VNTR谱系进行了最小生成树（MST）分析，以评估遗传相关性。 结果： 研究人员鉴定出40个分离株（5.72%）为RDRio，2018年（n=20；5.21%）和2023年（n=20；6.35%）之间的流行率无显著差异。WGS证实，主要的亚谱系为4.3.4.1和4.3.4.2，均属于谱系4（欧美洲）。基因型耐药谱将32.1%（9/28）的测序分离株归类为耐多药结核病（MDR-TB），7.1%（2/28）归类为广泛耐药前结核病（pre-XDR-TB）。MST分析显示，来自厄瓜多尔的RDRio分离株主要聚集在不同的克隆复合体中，并且与国际参考菌株（包括委内瑞拉分离株）基本保持隔离。 讨论： 5.72%的总体RDRio流行率相对于2012–2016年基线报告的2.09%增加了近三倍，尽管在2018–2023年期间保持稳定，且与委内瑞拉等高流行地区相比仍处于较低水平。尽管流行率相对较低，但RDRio基因型与大量的耐药负担相关。占主导地位的厄瓜多尔RDRio克隆复合体与国际参考菌株（包括委内瑞拉分离株）的遗传隔离并不支持近期与委内瑞拉侨民相关的输入。尽管有其局限性，经典的分型方法仍然是监测与MDR-TB相关的目标MTB菌株（如RDRio）的一种有效且经济的可行方法，适用于像厄瓜多尔这样的资源有限地区。

论文解读：厄瓜多尔结核分枝杆菌RDRio基因型的分子流行病学追踪

一、研究背景与科学问题

结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）引起的全球最致命的传染病之一，耐药结核病（DR-TB）的出现对防控构成重大威胁。厄瓜多尔被列为上中等负担国家，发病率约为每10万居民66.2例，且在2015-2024年间是全球九个（南美洲唯一）向更严重类别转变的国家。拉丁美洲的MTB群体结构主要由欧美洲谱系4主导，其中拉丁美洲-地中海（LAM）亚谱系最为普遍。RDRio基因型是LAM家族的一个主要基因型，最早在巴西里约热内卢发现，其特征是独特的26.3 kb连续DNA缺失导致融合基因Rv3346c/55c。流行病学和临床研究表明，RDRio菌株与毒力增强、空洞性肺病频率更高以及强烈的耐多药（MDR）倾向相关。

在厄瓜多尔，此前唯一的RDRio基因型基线研究（2012-2016年）报告了2.09%的低流行率，并发现29.4%的RDRio分离株为耐多药结核病（MDR-TB），近一半对异烟肼耐药。自那以后，流行病学格局可能因大规模移民流动而重塑，特别是来自委内瑞拉的移民——该国RDRio基因型高度流行，在研究分离株中占比高达69.8%。截至2023年7月，至少有502,200名委内瑞拉移民进入厄瓜多尔（总人口1700万），这种人口结构变化可能通过引入高传播性和耐药性的RDRio菌株影响MTB群体结构。因此，本研究旨在更新厄瓜多尔2018年和2023年RDRio基因型的分子流行病学，并表征其当前流行率、基因型多样性、遗传相关性及耐药谱。

二、研究方法概述

研究人员从厄瓜多尔国家结核分枝杆菌参比实验室（CRN-Micobacterias）的菌株库中获取了2018年（384株）和2023年（315株）共699份临床MTB分离株。采用双重PCR对所有分离株进行RDRio基因型筛查。随后对阳性分离株进行24位点MIRU-VNTR分型和spoligotyping以评估遗传谱系。此外，对28株RDRio阳性分离株进行了全基因组测序（WGS），使用TBProfiler软件确定系统发育谱系/亚谱系并推断基因型耐药谱。利用MIRU-VNTR图谱进行最小生成树（MST）分析，结合2012-2016年基线数据和来自巴西、葡萄牙、俄罗斯、哥伦比亚、中国和委内瑞拉的国际参考菌株，评估遗传相关性。统计检验使用卡方检验（Yates校正）。

三、主要研究结果

3.1 RDRio基因型的流行率

通过双重PCR筛查699份临床MTB分离株，共鉴定出40个RDRio阳性分离株，总体流行率为5.72%（95% CI, 4.23–7.70%）。其中2018年为20株（5.21%；95% CI, 3.40–7.91%），2023年为20株（6.35%；95% CI, 4.15–9.60%），两年间差异无统计学意义（卡方检验Yates校正，p=0.63）。值得注意的是，3个分离株同时扩增出野生型（530 bp）和RDRio特异性（1175 bp）产物，提示同一标本中存在RDRio与非RDRio混合感染。地理分布显示，RDRio阳性分离株主要集中于沿海省份，其中瓜亚斯省（Guayas）和洛斯里奥斯省（Los Ríos）各11株。

3.2 基于MIRU-VNTR和Spoligotyping的基因型多样性

对40株RDRio阳性分离株进行24位点MIRU-VNTR分型，全部获得可解读图谱。MIRU-VNTRplus平台自动谱系分配结果显示，23株鉴定为LAM，3株为Haarlem，2株为S型，1株为Uganda I，另有11株因最佳匹配距离超出相似阈值而未分配。对32株进行spoligotyping，28株鉴定为LAM，其余分别为S型、TUR、Uganda II/Ghana和West African 1。合并两种方法后，36株（90.0%）成功鉴定：32株为LAM，2株为Haarlem，1株为S型，1株为Uganda I，4株未分配。

3.3 基于WGS的亚谱系分配与基因型耐药谱

对28株RDRio阳性分离株进行WGS分析。TBProfiler亚谱系分配鉴定出16株为4.3.4.1亚谱系，6株为4.3.4.2，2株为4.3.4，1株为4.3.3，均属谱系4（欧美洲），与LAM命名一致；另有1株为4.4.1.1（S型），2株为4.1.1（X型）。2个分离株显示混合感染证据。基因型耐药预测分类结果为：12株（42.9%）为泛敏感，4株（14.3%）为异烟肼耐药/利福平敏感结核病（Hr-TB），9株（32.1%）为预测耐多药结核病（MDR-TB），2株（7.1%）为预测广泛耐药前结核病（pre-XDR-TB），1株（3.6%）携带氟喹诺酮类耐药突变但不满足MDR/RR-TB标准。

3.4 最小生成树（MST）分析

基于24位点MIRU-VNTR图谱的MST分析纳入49株厄瓜多尔RDRio分离株（本研究与2012-2016年基线研究）。按研究年份标记节点时，鉴定出两个主要克隆复合体：一个主要由2018-2023年分离株组成，另一个主要由2012-2016年分离株组成。按省份标记时，瓜亚斯省和洛斯里奥斯省的分离株各自集中在MST的不同区域。加入61株国际参考菌株（巴西、葡萄牙、俄罗斯、哥伦比亚、中国、委内瑞拉）进行第二次MST分析时，大多数厄瓜多尔分离株聚集在一个不包含其他国家菌株的独立分支内，仅有少数厄瓜多尔分离株与国际菌株混合分布。

四、讨论与结论总结

本研究更新了厄瓜多尔MTB RDRio基因型的分子流行病学数据。2018-2023年总体流行率为5.72%，较2012-2016年基线的2.09%增加近三倍，但仍远低于委内瑞拉等邻国的高流行水平（高达69.8%）。这一增长可能源于真实的流行病学变化或采样地理构成的差异。MIRU-VNTR和spoligotyping联合分析将多数RDRio阳性分离株归入LAM家族（80.0%），但部分分离株被分配到非LAM家族，这可能是由于spoligotyping在欧美洲谱系内的鉴别力有限及趋同进化所致。WGS确认优势亚谱系为4.3.4.1和4.3.4.2，并揭示了经典方法无法完全分辨的谱系分配。基因型耐药谱显示32.1%为MDR-TB，7.1%为pre-XDR-TB，与RDRio基因型与MDR的强关联性一致。MST分析揭示了一个时间上的克隆复合体转换趋势，且占主导地位的厄瓜多尔克隆复合体与国际参考菌株（包括委内瑞拉菌株）遗传隔离，不支持近期委内瑞拉移民大规模输入RDRio菌株的假说，而较小的混合子集则与跨国引入相符。

研究结论：厄瓜多尔MTB RDRio基因型的流行率仍然相对较低，尤其是与委内瑞拉等邻国相比。研究结果不支持近期大量委内瑞拉移民向厄瓜多尔输入RDRio菌株的强烈证据。然而，尽管流行率低，RDRio基因型与耐药结核病的关联表明，定期监测这些菌株将有助于加强厄瓜多尔的结核病监测和控制策略。