《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Diosbulbin B aggravates doxorubicin-induced hepatotoxicity with PI3K/AKT signaling and redox-inflammatory stress responses
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目的：本研究评估了黄独素B（diosbulbin B，DB）是否影响阿霉素（doxorubicin，DOX）诱导的肝毒性，并进一步表征了氧化还原相关生化指标、线粒体膜电位、炎症应激相关蛋白及DNA损伤反应相关蛋白的关联变化。方法：研究人员对ICR小鼠给予DOX
目的：本研究评估了黄独素B（diosbulbin B，DB）是否影响阿霉素（doxorubicin，DOX）诱导的肝毒性，并进一步表征了氧化还原相关生化指标、线粒体膜电位、炎症应激相关蛋白及DNA损伤反应相关蛋白的关联变化。方法：研究人员对ICR小鼠给予DOX和/或DB处理，以评估肝损伤和血清生化变化；使用LO2肝细胞样细胞作为简化体外模型，评估细胞活力、核形态、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放和线粒体膜电位；进行批量RNA测序（RNA sequencing）和蛋白质印迹（Western blot），以表征DB与DOX联合暴露相关的转录组和蛋白表达变化。结果：DB联合给药与DOX处理小鼠体重降低、较为相似的组织病理学改变以及血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性升高相关。氧化还原相关生化指标呈非经典模式，包括处理组谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平升高、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平降低和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性降低。这些变化提示氧化还原相关生化状态改变，而非特定氧化性细胞死亡机制的直接证据。在LO2细胞中，DB在DOX暴露期间进一步降低细胞活力、增加LDH释放、改变核形态并增强线粒体膜去极化。DOX+DB与DOX组比较共鉴定出1221个差异表达基因，其中130个上调、1091个下调。富集分析显示与DNA修复、细胞周期调控、染色质组织和应激反应过程相关的条目和通路。联合处理还与磷酸化-PI3K/PI3K、磷酸化-AKT/AKT、p38、TXNIP、IL-6和IL-8水平升高，以及p53和GADD45A水平降低相关。结论：DB联合处理与DOX相关肝毒性增强及LO2细胞细胞毒性变化增加相关。联合暴露伴随线粒体膜去极化、非经典氧化还原相关生化改变、炎症和应激相关蛋白表达增加以及p53和GADD45A丰度降低。由于未进行脂质过氧化依赖性细胞死亡、铁死亡（ferroptosis）、氧化性凋亡（oxytosis）、坏死性凋亡（necroptosis）和DNA损伤的直接检测，现有数据不能确定特定的氧化性细胞死亡机制。
传统中医药（traditional Chinese medicine，TCM）作为慢性病和癌症的补充治疗手段在全球应用日益广泛，草药与常规药物合用日渐普遍。尽管许多草药被认为安全，但部分含内在毒性成分，可能通过草药-药物相互作用影响合并用药的疗效或毒性，化疗期间尤为值得关注。薯蓣（Dioscorea bulbifera L.）是用于治疗甲状腺肿、炎症、出血、蛇咬伤和肿瘤的传统药用植物，但已有大量临床和实验证据表明其与肝损伤相关。黄独素B（DB）是薯蓣中的主要呋喃萜类成分，被认为是其肝毒性关键成分之一，经细胞色素P450介导的代谢活化生成反应性中间体，共价结合细胞蛋白导致肝细胞损伤。阿霉素（DOX）是广泛使用的蒽环类化疗药物，其临床应用受累积性器官毒性限制，除心脏毒性外，还可通过活性氧产生、线粒体功能障碍、炎症激活、代谢紊乱和DNA损伤相关应激反应等诱导肝损伤。目前多数天然产物研究集中于抗氧化、抗炎或细胞保护干预，而对可能增加化疗相关器官损伤易感性的毒性草药成分知之甚少。已有研究报道薯蓣暴露可延迟DOX排泄并加重DOX诱导的心脏和肾脏毒性，但所用为复杂植物制剂，且未聚焦于纯化DB的肝毒性。因此，本研究旨在明确纯化DB是否加重DOX诱导的肝毒性，并改变肝细胞氧化还原和应激反应网络。
研究人员采用无特定病原体（SPF）级雄性ICR小鼠（4–6周龄，18–22 g）作为体内模型，随机分为对照（Ctl）、DOX、DOX+DB和DB组，于第1、3天分别腹腔注射DOX（3 mg/kg）和/或灌胃DB（100 mg/kg），第9天处死采样；同时以人LO2肝细胞样细胞作为体外模型，给予DOX（2 μM）和/或DB（200 μM）处理24 h。主要技术方法包括：苏木精-伊红（H&E）染色评估肝组织病理；生化试剂盒检测血清ALT、AST、GSH、MDA、SOD和LDH；MTT法检测细胞活力；DAPI染色观察核形态；JC-1染色检测线粒体膜电位；LDH释放实验评估细胞膜损伤；批量RNA测序（Illumina NovaSeq 6000平台）结合GO、KEGG和GSEA富集分析转录组变化；Western blot检测PI3K、AKT、p38、TXNIP、IL-6、IL-8、p53、GADD45A等蛋白；免疫荧光验证IL-6、p38和NF-κB p65表达。
研究结果如下：
3.1 DOX和DB对小鼠体重、肝组织学和血清生化指标的影响
通过比较四组小鼠的体重变化、肝组织H&E染色和血清生化指标，发现DOX和DOX+DB组体重低于对照组，DB组与对照组相当；DOX+DB组血清ALT和AST活性高于DOX组；肝组织病理学改变在DOX组与DOX+DB组均表现为炎症细胞浸润和肝结构紊乱。血清GSH水平在DOX和DOX+DB组升高，MDA水平降低，SOD活性降低，呈非经典氧化还原模式。
3.2 DOX和DB对LO2细胞活力、核形态、线粒体膜电位和LDH释放的影响
MTT结果显示，DB联合DOX进一步降低LO2细胞活力；DAPI染色显示DOX+DB组细胞密度降低、核固缩和形态异常更明显；JC-1染色显示DOX+DB组红色荧光减弱、绿色荧光增强，提示线粒体膜去极化加剧；LDH释放实验显示DOX+DB组上清LDH活性高于DOX组。
3.3 对照、DOX和DOX+DB组的转录组图谱
RNA测序主成分分析显示Ctl、DOX和DOX+DB三组转录组谱明显分离。DOX+DB与DOX比较共鉴定1221个差异表达基因（130个上调、1091个下调）。GO和KEGG富集分析显示差异基因富集于转录调控、细胞分裂、DNA修复、DNA损伤刺激应答、双链断裂修复、同源重组、染色质组织、有丝分裂纺锤体检查点信号等条目与通路；GSEA显示有丝分裂纺锤体组装检查点信号、DNA双链断裂加工和DNA损伤反应信号转导调控相关基因集富集。
3.4 DOX和DB对LO2细胞中选定信号和应激反应蛋白的影响
Western blot检测显示，DOX+DB组p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值高于DOX组；p38、TXNIP、IL-6和IL-8表达水平在DOX+DB组升高；GADD45A和p53表达在DOX+DB组低于对照组和DOX组；UBLCP1表达在各组间差异较小。
3.5 LO2细胞中IL-6、p38和NF-κB p65的免疫荧光染色
免疫荧光染色显示，与对照组相比，DOX和DOX+DB组IL-6、p38和NF-κB p65荧光强度均增强，DOX+DB组最强，与Western blot结果一致，提示联合暴露增强炎症和应激相关蛋白表达。
讨论部分指出，DB联合给药与更明显的DOX相关肝损伤相关，但氧化还原指标呈非经典模式（GSH升高、MDA降低、SOD降低），不能作为脂质过氧化依赖性氧化性细胞死亡的直接证据。PI3K/AKT信号增强可能为适应性应激反应；p38检测为总蛋白而非磷酸化形式；TXNIP升高伴随IL-6/IL-8升高，但缺乏上游机制和干预实验；p53和GADD45A降低与转录组中DNA损伤应答相关通路改变一致，但未直接检测DNA损伤。研究局限性包括未直接检测铁死亡、氧化性凋亡、坏死性凋亡等特定氧化性细胞死亡，未评估DB与DOX的药代动力学相互作用，LO2细胞代谢能力有限，未进行肝组织蛋白验证等。
结论（翻译）：总之，本研究表明黄独素B联合给药与小鼠阿霉素相关肝损伤增强及LO2细胞细胞毒性变化增加相关。联合暴露伴随线粒体膜去极化、非经典氧化还原相关生化改变、炎症和应激相关蛋白表达增加以及p53和GADD45A丰度降低。由于未进行脂质过氧化依赖性细胞死亡、铁死亡、氧化性凋亡、坏死性凋亡和DNA损伤的直接检测，现有数据不能确定特定的氧化性细胞死亡机制。未来需借助代谢能力更强的肝模型、肝组织验证、直接氧化性细胞死亡检测、DNA损伤测量、通路干预和药代动力学分析进一步阐明潜在机制和转化意义。
