白唇蛙（Hylarana raniceps）鼓膜与发声器官结构的性别二态性研究：基于婆罗洲沙捞越的形态学与组织学证据**

《BMC Zoology》：Tympanum and vocal apparatus structure of male and female white-lipped frog, Hylarana raniceps (Peters, 1871) (Amphibia: Anura: Ranidae) in Sarawak, Malaysian Borneo

　　

摘要 背景：无尾目动物的声学通讯涉及与声音产生和接收相关的特化结构，分别包括发声器官和鼓膜。这些结构在性别间的差异可能反映整体体型的变化或性别特异性的结构分化。然而，关于婆罗洲蛙科动物（特别是白唇蛙 Hylarana raniceps）声学相关形态的性别二态性信息仍然有限。 方法：本研究调查了来自马来西亚婆罗洲沙捞越的白唇蛙 H. raniceps 在鼓膜和发声器官形态上的性别二态性。研究人员共检查了采集自姆鲁山国家公园、加丁山国家公园、兰詹休闲公园、库巴国家公园和西姆詹森林保护区的24个个体。研究人员对鼓膜、吻肛长（SVL）和胫骨长（TL）进行了形态学观察和形态测量。经苏木精-伊红染色组织学处理后，研究人员获得了发声器官的5项线性测量数据。 结果：雄性白唇蛙 H. raniceps 表现出更大的发声器官结构，而雌性则具有更大的体型、胫骨长和鼓膜尺寸。性别二态性指数（SDI）表明发声器官测量值偏向雄性，而体型和鼓膜测量值偏向雌性。组织学观察显示雄性的周围肌肉组织发育明显更发达；然而，肌肉厚度未被直接量化。协方差分析（ANCOVA）显示鼓膜形态与吻肛长（SVL）密切相关（p < 0.001），且性别×SVL交互作用显著，表明存在性别特异的异速生长关系。在控制体型变异后，若干发声器官性状（PVPM和CPEP）在性别间仍保持显著差异，为性别形状二态性提供了证据。主成分分析（PCA）显示PC1解释了总形态变异的92.17%，主要与整体体型（特别是胫骨长TL）相关，而鼓膜测量值则贡献了额外变异。判别函数分析（DFA）使用原始形态变量对95.83%的个体进行了正确分类，使用PCA得分对91.67%的个体进行了正确分类。 结论：本研究证明白唇蛙 H. raniceps 的性别二态性涉及体型依赖性和性别特异性形态变异。雌性偏向的体型对鼓膜变异贡献显著，而雄性偏向的发声器官形态则表现出更强的性别特异性结构分化证据。尽管这些形态差异可能与声学通讯相关，但仍需进一步结合求偶鸣叫、听觉敏感性和行为数据的研究来确认其功能意义。这些发现为理解婆罗洲蛙科动物声学相关性别二态性提供了基线信息。

白唇蛙（Hylarana raniceps）声学相关形态性别二态性的系统研究：鼓膜与发声器官的形态学、组织学及多元统计分析**

一、研究背景与科学问题

无尾目动物的声学通讯在其社会互动和繁殖行为中至关重要，尤其在繁殖季节，性别特异的性选择压力可能导致声学相关结构（如发声器官和鼓膜）出现性别二态性。雄性无尾目动物通过产生求偶鸣叫来吸引配偶和进行领域性互动，而雌性则通过听觉系统接收这些声学信号并做出响应行为。在本研究中，“发声器官”这一术语操作性地指代所检查的喉部组件，包括环状软骨和杓状软骨及其相关肌肉组织。发声器官位于肺和口腔之间，与声带和舌骨相关联，对声音的产生和调节（包括音高、频率、脉冲重复率和鸣叫时长）具有重要作用。鼓膜则是声音接收和传导的关键结构，无尾目动物缺乏外耳道、耳廓和耳蜗，依赖鼓膜将中耳与外部环境分隔，并将声学振动传递至中耳腔，最终在内耳转换为电信号。

尽管声学相关形态的性别二态性已在多个无尾目谱系中得到记录，但针对婆罗洲蛙科动物的鼓膜与发声器官形态整合性定量评估仍然有限。白唇蛙 Hylarana raniceps 是一种广泛分布于婆罗洲低地的蛙科动物，栖息于成熟林和受干扰森林中，目前被列为世界自然保护联盟（IUCN）红色名录中的无危（Least Concern）物种。然而，该物种在鼓膜和发声器官上的性别差异程度及其功能意义仍不清楚。以往的研究主要聚焦于沙捞越蛙科动物的种间发声器官形态变异，而种内性别差异尚未被专门考察。因此，本研究旨在表征沙捞越白唇蛙 H. raniceps 的发声器官和鼓膜的形态及形态测量变异，并调查这些声学相关结构的性别二态性。研究人员假设发声器官和鼓膜会表现出性别特异的形态变异，并预测部分结构差异在控制体型变异后仍然存在，从而指示性别形状二态性（SShD）而非仅由体型差异所致。

二、研究设计与技术方法

研究人员于2024年4月至2025年8月期间，在马来西亚婆罗洲沙捞越的五个采样点进行了夜间野外调查，包括姆鲁山国家公园（4.05362 N, 114.85960 E）、加丁山国家公园（1.69527 N, 109.84092 E）、兰詹休闲公园（1.14225 N, 110.58283 E）、库巴国家公园（1.61153 N, 110.19587 E）和西姆詹森林保护区（1.25075 N, 110.81575 E）。采用目视遭遇调查法（VES）和声学检测法，在18:30至23:00时段内连续七天于每个采样点进行采集。共获得24个成年个体，包括11只雄性和13只雌性。雄性通过求偶鸣叫、声囊开口和前肢婚垫的存在来鉴定，雌性则通过缺乏这些雄性次级性征以及通常更大的体型来识别。样本经氯丁醇溶液安乐死后，解剖发声器官并固定于10%福尔马林中进行组织学处理。组织经石蜡包埋、切片（厚度3.5 μm）和苏木精-伊红（H&E）染色后，使用Olympus BX43显微镜在4倍放大下观察。形态测量包括体质量、吻肛长（SVL）、胫骨长（TL）以及左右鼓膜在水平、垂直和两个对角方向上的直径共8项测量值。发声器官的5项线性测量值（PVPM、CPBP、BPLP、LPEP、CPEP）基于六个标志点之间的距离获得。统计分析采用夏皮罗-威尔克正态性检验、莱文方差齐性检验、韦尔奇双样本t检验、威尔科克森秩和检验、协方差分析（ANCOVA）、主成分分析（PCA）和判别函数分析（DFA），使用R 4.6.1版本完成。

三、主要研究结果

白唇蛙 H. raniceps 鼓膜与发声器官的特征：该物种拥有一对水平椭圆形、近似圆形的鼓膜，与周围皮肤齐平，位于眼睛后方，无颞上皮肤褶覆盖，侧面观察完全可见。鼓膜周围存在明显的鼓膜环，可归类为突出型鼓膜。发声器官主要由杓状软骨和环状软骨组成，雄性和雌性均观察到围绕杓状软骨的厚肌肉组织。组织学观察显示，雄性具有明显更大且更细长的环状横纹肌纤维。

雄性与雌性鼓膜和发声器官的差异：15项鼓膜和发声器官形态测量数据的分析显示，性别二态性指数（SDI）范围从-0.5030（CPEP）到0.4129（胫骨长TL）。负SDI值（范围从-0.1132的LPEP到-0.5030的CPEP）表明雄性发声器官结构更大，反映雄性偏向的二态性；而吻肛长（SVL）、胫骨长（TL）和所有鼓膜测量值则表现出雌性偏向的二态性，正SDI值范围从0.1967（TDHL）到0.4129（TL）。韦尔奇双样本t检验和威尔科克森秩和检验显示，除LPEP（p = 0.184）外，大多数变量在性别间存在显著差异。莱文检验表明PVPM和CPEP存在显著的方差异质性（p = 0.001）。

协方差分析（ANCOVA）结果：以性别为固定因子、吻肛长（SVL）为协变量的ANCOVA显示，发声器官的PVPM（F_1,20 = 9.92，p = 0.005）和CPEP（F_1,20 = 10.14，p = 0.005）在控制体型后仍保持显著的性别差异，为发声器官的性别形状二态性（SShD）提供了证据。BPLP（F_1,20 = 5.42，p = 0.030）和LPEP（F_1,20 = 6.85，p = 0.017）则表现出显著的性别×SVL交互作用，表明体型与这些结构之间的关系在性别间存在差异。所有鼓膜测量值均表现出强烈的SVL效应（p < 0.001，TDHL为0.002），确认鼓膜尺寸随体型增大而增加，且所有鼓膜变量均表现出显著的性别×SVL交互作用（p < 0.05），指示性别特异的异速生长关系。然而，在控制体型后，任何鼓膜测量值的性别主效应均不再显著。

主成分分析（PCA）与判别函数分析（DFA）结果：PCA显示前两个主成分（PC1和PC2）共解释了97.12%的总变异。PC1解释了92.17%的变异（特征值5.2556），主要与胫骨长（TL）相关（载荷值0.965），表明体型是形态变异的主要来源。PC2解释了4.96%的变异（特征值1.2190），主要与鼓膜测量值相关，包括TDHL（0.393）、TDHR（0.384）、TDDaL（0.350）、TDDaR（0.341）、TDDbL（0.336）和TDDbR（0.370），表明鼓膜形态代表了超越一般体型成分的第二大形态变异轴。基于原始形态变量的DFA显示单一显著函数，典型相关系数为0.830，特征值为2.212，总体分类准确率达95.83%，正确分类了全部13只雌性和11只雄性中的10只，仅1只雄性被误分类为雌性。然而，整体判别函数未达到统计显著性（威尔克斯λ = 0.311，F_13,10 = 1.701，p = 0.202）。基于前两个主成分的DFA分类准确率为91.67%，正确分类了13只雌性中的12只和11只雄性中的10只。

四、讨论与结论

本研究证明白唇蛙 H. raniceps 的性别二态性涉及体型依赖性和性别特异性形态变异的组合。雌性偏向的体型（SSD）对鼓膜变异贡献显著，而雄性偏向的发声器官形态则表现出更强的性别特异性结构分化（SShD）证据。鼓膜形态与吻肛长（SVL）密切相关，但性别×SVL的显著交互作用表明鼓膜大小与体型之间的关系在性别间存在差异。雄性虽然绝对鼓膜尺寸较小，但相对于眼睛直径而言鼓膜大小与雌性相似，表明雄性具有较大的相对鼓膜尺寸。发声器官中PVPM和CPEP在控制体型后仍保持显著差异，而BPLP和LPEP则表现出性别特异的缩放关系。组织学观察显示雄性具有更发达的肌肉组织，这可能与声带振动控制和求偶鸣叫产生有关。尽管这些形态差异可能与声学通讯相关，但研究人员未记录求偶鸣叫特征或进行声学分析，因此其功能意义仍需进一步研究确认。判别函数分析（DFA）的高分类准确率（95.83%）表明所测量的形态性状具有潜在的性别区分能力，但需在更大数据集上验证。本研究为理解婆罗洲蛙科动物声学相关性别二态性提供了基线信息，未来研究应结合求偶鸣叫特征、听觉敏感性和行为数据，以确认这些形态差异的功能意义及其在声学通讯中的作用。