类风湿关节炎相关弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的B细胞受体（BCR）呈多反应性与自身反应性并结合蛋白修饰

《Arthritis Research & Therapy》：Diffuse large B cell lymphoma in rheumatoid arthritis express polyreactive and autoreactive BCRs binding protein modifications

　　

背景：类风湿关节炎（RA）患者发生弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的重要危险因素是高累积疾病活动度。B细胞内在因素和自身免疫过程可能起作用，研究人员假设B细胞受体（BCR）自身反应性可能驱动淋巴瘤发生和/或淋巴瘤细胞存活。RA主要与抗瓜氨酸化蛋白自身抗体相关，但患者也可具有其他抗修饰蛋白自身抗体，例如针对丙二醛/乙醛（MDA/MAA）加合物的抗体，其与疾病活动度和炎症相关。在此，研究人员通过BCR下一代测序（NGS）和再表达，探讨了并发淋巴瘤的RA患者DLBCL特性。

方法：共纳入瑞典AUTO-LYMPHOMA队列的22例RA-DLBCL患者。从固定组织中提取肿瘤DNA，通过多重PCR扩增全长V_H/V_L片段，并使用Illumina测序。计算分析评估克隆变异。合成优势序列并表达为重组单克隆抗体，用于抗原结合分析。

结果：从9例RA-DLBCL患者获得完整的V_H/V_L淋巴瘤组织序列。肿瘤内克隆型多样性通常较低，6例患者获得优势配对重链和轻链BCR序列。3例患者DLBCL克隆型中的氨基酸变异提示克隆内演化。6例中2例肿瘤BCR的V_H和V_L体细胞高突变（SHM）较少（≤5个错配），3例具有高突变（>15个V_H或V_L错配）。未检测到V_H/V_L使用偏好。来自5例患者的6个淋巴瘤BCR被表达为重组单克隆抗体，并通过ELISA（酶联免疫吸附试验）和固相微阵列（>400种抗原）评估其与自身抗原的结合。所有患者来源的淋巴瘤BCR均为CCP2（环瓜氨酸肽2）阴性，但5个结合MDA/MAA-蛋白。其中3个在自建检测中显示多反应性结合，其中2个进一步在抗原微阵列上显示显著广泛的多反应性。重要的是，1例患者的淋巴瘤BCR对MDA/MAA-蛋白具有高特异性，另一例患者的DLBCL-BCR仅结合甲基化蛋白。

结论：数据提示RA-DLBCL淋巴瘤发生中多反应性与抗MDA/MAA自身反应性之间可能存在联系。研究人员假设高炎症负荷可能增加抗原负荷，从而可能触发多反应性和修饰蛋白B细胞反应和/或维持淋巴瘤细胞存活。

研究背景：多种自身免疫病与B细胞淋巴瘤风险增加相关，包括Sj?gren病、系统性红斑狼疮和类风湿关节炎（RA）。RA患者B细胞淋巴瘤风险较一般人群增加约2–3倍，高疾病活动度被视为最强危险因素；Hellgren等的研究提示，有效生物改善病情抗风湿药（bDMARDs）的引入可能降低RA患者淋巴瘤风险。RA合并淋巴瘤者以弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）为主，且常为活化B细胞样（ABC）或非生发中心B细胞样（non-GCB）亚型；ABC DLBCL细胞系依赖持续性BCR信号存活，因此研究者提出某些DLBCL的B细胞受体（BCR）可能结合自身抗原，驱动慢性BCR活化并维持淋巴瘤细胞生存，但该点主要在细胞系研究中验证。在自身抗体阳性患者中，自身抗原驱动BCR活化对淋巴瘤发生的重要性、BCR特异性及其与基础自身免疫病的关系仍不清楚。RA中常见抗瓜氨酸化蛋白抗体（ACPA）和类风湿因子（RF），并可出现抗丙二醛/乙醛（MDA/MAA）修饰蛋白IgG抗体，后者与疾病活动度和炎症标志物相关。研究人员因此利用瑞典AUTO-LYMPHOMA队列，对RA-DLBCL肿瘤BCR进行测序和再表达，分析克隆内演化及自身抗原特异性。

关键技术方法（≤250字）：研究基于瑞典AUTO-LYMPHOMA队列的22例RA-DLBCL患者。对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织提取DNA，以多重PCR扩增全长V_H/V_L片段并行Illumina测序；采用nf-core/airflow流程、IgBlast及IMGT参考完成注释，计算克隆型及克隆内变异。将优势V_H/V_L序列合成并表达为重组IgG₁单克隆抗体，通过自建ELISA、可溶性膜蛋白（SMP）多反应性ELISA、覆盖>400种抗原的固相微阵列及CCP2、RF、抗核抗体（ANA）等检测评估抗原结合；另以qPCR检测EB病毒（EBV）。

研究结果：
临床特征：22例RA-DLBCL患者中，qPCR在3例（14%）肿瘤组织检出EBV；9例肿瘤组织质量足以进行BCR测序，其中位诊断年龄72岁，44%为女性。2例可测序患者（RAL10、RAL04）EBV可检出；RAL10所有活检均EBV阳性，RAL04两份组织中仅一份可检出，且仅EBV阴性组织成功建库。9例中7例（78%）血清抗CCP2 IgG和/或RF IgM阳性；6例在采血前已接受抗CD20利妥昔单抗治疗。所有患者RA病程>2年（中位21年），89%在淋巴瘤诊断前使用过改善病情抗风湿药（DMARDs）。

免疫球蛋白V(D)J基因使用：V_H测序9例成功、V_L测序7例成功；RAL10分析了3份活检。6例鉴定出优势V_H克隆型，占该患者重链测序数据66–99%；优势克隆型内最高频独特序列占克隆型总reads的14–71%。2/6例优势序列V_H和V_L的SHM较低（≤5个错配），3例SHM较高（V_H或V_L>15个错配）；2例存在SHM引入的N-糖基化位点。5例淋巴瘤V_H属V_H3家族，1例（RAL10）肿瘤组织优势表达V_H1-2；未检测到V_H/V_L使用偏好。

淋巴瘤BCR抗原选择及肿瘤内持续BCR演化的证据：对优势肿瘤克隆型中最丰富序列的V_H替换突变定位显示，RAL01、RAL03和RAL07的SHM在互补决定区（CDR）和框架区（FW）均导致氨基酸替换。对优势V_H谱系内氨基酸序列分析发现，RAL01、RAL03、RAL04最高频序列分别约占谱系reads的70%，第二高频为3–5%；RAL07、RAL09、RAL10可见多个15–35%的变异序列，前6位氨基酸序列比对显示特定位点反复转换，且多位于框架区，提示肿瘤细胞持续克隆内演化，但不必然为抗原驱动。

淋巴瘤BCR显示以多反应性为主及与丙二醛蛋白加合物结合：来自5例患者的6株重组单克隆淋巴瘤BCR中，SMP多反应性ELISA显示RAL10两株明确多反应，RAL01和RAL09边缘阳性。抗原微阵列中，RAL01、RAL09及RAL10两株呈显著高度多反应性，结合27–70%的抗原；阳性对照JB40和ED38为86%，阴性对照及RAL03、RAL04分别约0.2–1.3%、1.6%、0.9%。RAL10:C84较RAL10:C214多反应性更强（71% vs 27%）。所有淋巴瘤BCR均CCP2阴性，但6株中5株结合MDA/MAA-蛋白；RAL03和RAL09在ELISA中较特异结合MDA/MAA，加入氰基硼氢化钠阻断MAA加合物后结合显著降低，提示偏好MAA。RAL04主要结合甲基化蛋白且其他抗原结合低。所有肿瘤来源抗体ANA均无显著反应。RAL10两株仅框架区2第37位V37/L37不同，L37株多反应性更高；EBV阳性与多反应性无明确对应，仅RAL10属高度多反应且EBV阳性。

讨论与结论：研究显示RA-DLBCL肿瘤BCR呈高度自身反应性，表现为多反应性或针对MDA相关氧化修饰蛋白的反应性；SHM水平与多反应性未见关联。未见共享基因使用偏好，且无V_H4-34编码，而多数为V_H3家族。EBV检出率为14%，样本量有限，不能就EBV与BCR抗原反应性作结论。多反应性为低亲和力结合多种无关抗原，可能涉及结合位点表面柔性、电荷或疏水性；RA患者naive B细胞库中多反应性B细胞比例增加，可能与B细胞耐受缺陷有关。不同多反应性检测（SMP ELISA与抗原阵列）可捕获不同类型非特异相互作用；多反应性克隆未显示显著ANA反应。MDA/MAA方面，IgM抗MDA/MAA属天然抗体，IgG抗MDA/MAA与炎症相关，并在RA中升高、与疾病活动度和炎症标志物相关；IgG抗MDA可激活炎症通路，可能形成恶性循环。部分慢性淋巴细胞白血病（CLL）BCR亦具抗MAA反应性。所有淋巴瘤抗体均非抗CCP2或特异性RF，提示淋巴瘤起源不同于经典RA特异性自身免疫；抗MAA反应性可能连接炎症、氧化应激与RA患者淋巴瘤风险。多数患者淋巴瘤BCR有高或中等SHM，类似生发中心经历细胞；RAL01、RAL03、RAL07的CDR替换积累提示抗原选择。3例克隆型存在克隆内氨基酸变异，提示持续克隆演化；但多重PCR和Illumina测序存在错误，DNA降解及扩增偏倚影响变异比例，真实克隆内变异需单细胞方法确认。队列仅9例可测序，样本量有限但队列独特。

研究结论（翻译）：总之，该研究揭示RA-DLBCL患者的淋巴瘤BCR可显示高度多反应性，观察到的克隆内多样性提示肿瘤内可能存在演化选择。研究还显示，部分患者肿瘤B细胞受体并非泛反应性，而是对MDA/MAA修饰蛋白显示较特异结合。研究人员假设RA患者的高且慢性炎症与淋巴瘤发生风险增加相关，可能促进MDA/MAA加合物等修饰自身抗原形成，从而驱动抗MDA⁺自身反应性和多反应性B细胞慢性过度活化；在炎症及RA相关耐受降低背景下，这些活化B细胞可进入生发中心，并在持续刺激下被假设具有更高风险获得与恶性转化为DLBCL相关的特征。