播娘蒿（Descurainia sophia）种子水醇提取物抗多重耐药伤寒沙门菌（Salmonella typhi）的体外与整合计算研究：基于DNA旋转酶A靶点的分子对接与分子动力学模拟

《International Microbiology》：Evaluation of antibacterial activity of hydroethanolic seed extract of Descurainia sophia against multidrug-resistant Salmonella typhi isolated from typhoid patients: an integrated in silico and in vitro study

　　

摘要专业翻译 伤寒热由伤寒沙门菌（Salmonella typhi）引起，至今仍是重大公共卫生问题，多重耐药（multidrug-resistant, MDR）及广泛耐药菌株在巴基斯坦等流行地区已使口服治疗选择所剩无几。播娘蒿（Descurainia sophia（L.））种子在尤纳尼医学（Unani）及民间医学中用于发热性疾病，含有强心苷（cardenolides）、硫代葡萄糖苷衍生的异硫氰酸酯（isothiocyanates）及长链脂肪酸，但其对MDR伤寒沙门菌的活性及可能的分子靶点此前尚未被研究。研究人员因此整合了计算机模拟（in silico）与体外（in vitro）方法，评估该种子水醇提取物对临床MDR伤寒沙门菌分离株的作用。研究人员构建了14种文献报道的种子化合物库，通过ADMET分析（admetSAR 3.0）筛选出三种类药性强心苷（helveticoside、evomonoside和strophanthidin）；以莫西沙星（moxifloxacin）和吉米沙星（gemifloxacin）为参照，将这些化合物与DNA旋转酶A（DNA gyrase A）进行分子对接，并将排名最前的先导化合物helveticoside进行了50 ns全原子分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟。提取物通过GC-MS和FTIR进行表征，并以纸片扩散法和肉汤微量稀释法（CLSI M07）对5株MDR分离株（MDR-ST1至MDR-ST5）进行测试。GC-MS确认了14种化合物库中的13种（占总离子色谱图面积的91.4%），包括三种先导化合物；erysimoside是唯一未检出的化合物。Helveticoside（?9.7 kcal/mol）和evomonoside（?9.5）的预测亲和力高于莫西沙星（?7.9）和吉米沙星（?8.2）；strophanthidin得分为?8.5。在MD模拟中，helveticoside复合物保持稳定（配体RMSD约1.8 ?，未发生解离；蛋白Cα RMSD约2.2–2.5 ?，约15 ns后趋于稳定），12个残基（包括ARG31、SER185和GLN288）在超过95%的模拟帧中与配体接触，其中6个残基也存在于对接构象中。提取物以剂量依赖方式抑制全部5株分离株（25–100 mg/mL时平均抑菌圈为11.5–17.15 mm；莫西沙星为19.3±0.9 mm，因提取物为粗提物而作描述性报告），几何平均MIC为8.4 mg/mL（范围6.25–12.5），所有分离株的MBC/MIC=2，符合杀菌活性特征。FTIR显示与主要成分类别一致的功能基团。 对接与MD共同提出假设：强心苷成分对DNA旋转酶A的抑制可能有助于提取物的抗菌效应。MD模拟支持所预测的helveticoside结合模式的结构稳定性，但并未证明酶抑制活性，且提取物中的脂肪酸和异硫氰酸酯也可能有所贡献。总体而言，该粗提物在高浓度下对MDR伤寒沙门菌表现出体外抗菌活性，该研究提供了一个可检验的机制假说，需通过生物活性导向分级、纯化合物测试及靶点结合实验加以验证。

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一、研究背景与问题

伤寒热是由伤寒沙门菌（Salmonella typhi）引起的系统性发热疾病，通过粪-口途径经污染的食物和水传播。世界卫生组织估计每年约有900万至1100万病例，超过11万人死亡，疾病负担以南亚和撒哈拉以南非洲的低中收入国家最为沉重。巴基斯坦正面临紧迫的流行病学紧急状况，是全球伤寒发病率最高的地区之一，信德省和旁遮普省广泛耐药（extensively drug-resistant, XDR）伤寒沙门菌株的检出令人震惊。

在治疗方面，一线抗生素氯霉素、氨苄青霉素和复方新诺明已使用多年；随后引入的氟喹诺酮类药物（如环丙沙星、加替沙星）和第三代头孢菌素曾是治疗里程碑，但广泛的多重耐药（MDR，定义为对≥3类抗菌药物耐药）已削弱这些方案的有效性。XDR伤寒沙门菌对全部标准一线和二线口服药物耐药，其机制涉及染色体突变介导的氟喹诺酮耐药（fluoroquinolone resistance, FQR）以及产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）质粒的存在。此外，阿奇霉素和碳青霉烯类药物的耐药性也在上升。自2016–2019年信德省海得拉巴首次暴发以来，巴基斯坦XDR伤寒沙门菌确诊病例已超过1万例，2017–2019年多实验室网络研究发现培养确诊的伤寒沙门菌中57%为XDR，阿奇霉素和碳青霉烯类成为许多临床场景中仅存的主要治疗选择。日益增长的抗菌药物耐药性凸显了寻找针对MDR和XDR伤寒沙门菌的新型生物活性化合物的必要性。

播娘蒿（Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl，十字花科，俗名khubkalan、播娘蒿）是一年生草本植物，分布于巴基斯坦、印度、伊朗和中亚等多个温带和亚热带地区。其种子在尤纳尼医学、阿育吠陀医学、中国传统医学以及巴基斯坦民间实践中均有药用记载，用于发热性疾病、胃肠炎、呼吸道炎症及抗感染。种子中已记录的植物化学成分包括强心苷（helveticoside、evomonoside、strophanthidin、erysimoside）、硫代葡萄糖苷及其水解产物（烯丙基异硫氰酸酯、苄基异硫氰酸酯）、长链脂肪酸（棕榈酸、油酸、芥酸、亚麻酸、亚油酸）及有机硫化合物。这些化合物类别均已被独立报道具有抗菌活性，包括强心苷、脂肪酸和异硫氰酸酯，脂肪酸介导的膜破坏还涉及调节细菌耐药性。

药物发现的早期阶段涉及昂贵的湿实验室检测。采用ADMET分析、分子对接和靶点预测等计算方法的计算机模拟（in silico）分析，可作为优先排序生物活性植物化学成分和预测药理学靶点的高效且经济有效的工具。然而，此前文献中尚无采用整合计算机模拟与体外方法研究播娘蒿对MDR伤寒沙门菌抗菌潜力的报道。因此，本研究旨在通过整合计算与实验方法，系统评估播娘蒿种子提取物对临床MDR伤寒沙门菌分离株的抗菌活性，并探索其可能的分子靶点机制。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用了整合双轨研究设计，包括计算机模拟计算管线和体外实验管线两大路径。主要关键技术方法包括以下几项。第一，通过三阶段文献挖掘策略，从Google Scholar和IMPPAT数据库系统检索播娘蒿种子来源的植物化学成分，经严格纳入标准筛选后构建了包含14种化合物的植物化学数据库。第二，使用admetSAR 3.0网络服务器对14种化合物进行ADMET多参数类药性筛选，设定了分子量、logP、Ames致突变性、CYP酶抑制、拓扑极性表面积、氢键受体/供体、人体肠道吸收、血浆蛋白结合及P-糖蛋白底物等多项阈值标准。第三，以伤寒沙门菌DNA旋转酶A（PDB ID: 5ZTJ，2.29 ?）为分子靶点，使用AutoDock Vina（经PyRx v0.8）对12种具有可用三维结构的化合物进行分子对接，以莫西沙星和吉米沙星为参照药物，网格盒定位于已知氟喹诺酮结合口袋。第四，对排名最前的ADMET优先先导化合物helveticoside与DNA旋转酶A复合物进行了50 ns全原子分子动力学模拟，使用OpenMM 8平台，配体以Open Force Field Sage（openff-2.1.0）力场参数化，蛋白以Amber ff14SB力场描述，TIP3P水模型溶剂化，0.1 M NaCl离子强度。第五，体外实验方面，研究人员在巴基斯坦旁遮普省木尔坦地区采集播娘蒿成熟干燥种子，经分类学家鉴定并存放标本凭证，采用70:30（v/v）乙醇:水以10:1（v/w）溶剂比室温浸渍72小时制备水醇提取物，三次独立重复的平均提取率为3.72±0.04%。第六，对提取物进行了pH、比重、颜色、气味、极性等理化性质表征及OECD 404指南急性皮肤毒性测试。第七，采用GC-MS（Agilent 7890B/5977A，DB-5MS毛细管柱）对提取物进行植物化学表征，以NIST 2020质谱库匹配（匹配分数≥80%）和保留指数偏差（≤15单位）双重标准确认化合物。第八，从木尔坦一家转诊医院的5名伤寒确诊患者血液样本中分离鉴定MDR伤寒沙门菌，经革兰染色、氧化酶试验、三糖铁琼脂、脲酶试验、动力试验及Vi抗血清玻片凝集六项标准确认，5株分离株（MDR-ST1至MDR-ST5）来自不同入院日期以确保流行病学独立性，并经Kirby-Bauer纸片扩散法（CLSI M02-A13）确认MDR状态。第九，采用Kirby-Bauer纸片扩散法在MH琼脂上评估提取物（25、50、75、100 mg/mL）对5株分离株的抑菌活性，莫西沙星和吉米沙星（自制20 μg/纸片，经ATCC 25922质控验证）作为阳性对照，10% DMSO作为阴性对照。第十，采用肉汤微量稀释法（CLSI M07）在96孔板中测定MIC和MBC，提取物二倍系列稀释浓度为0.78至100 mg/mL，最终DMSO浓度不超过0.5%。第十一，采用FTIR光谱（Perkin-Elmer AX-1，400–4000 cm^?1）对提取物进行功能基团分析。统计分析采用IBM SPSS Statistics v25和GraphPad Prism v10.0，使用双因素混合效应方差分析（浓度固定效应、分离株随机区组效应，REML估计）处理纸片扩散数据，以解决重复嵌套结构避免伪重复问题。

三、主要研究结果

1. 播娘蒿种子生物活性化合物的鉴定。 通过系统文献挖掘和数据库筛选，研究人员从播娘蒿种子中鉴定出14种生物活性化合物，分属四大植物化学类别：强心苷及其苷元（helveticoside、strophanthidin、evomonoside、erysimoside）、硫代葡萄糖苷水解产物（苄基异硫氰酸酯、烯丙基异硫氰酸酯、3-丁烯腈）、长链脂肪酸（硬脂酸、棕榈酸、油酸、芥酸、亚麻酸、亚油酸）及有机硫化合物（二烯丙基二硫化物）。

2. 提取物GC-MS分析。 GC-MS在DB-5MS毛细管柱上解析出13个色谱峰（峰A–M），全部13个峰均通过NIST 2020库鉴定（匹配分数≥80%，保留指数偏差≤15单位），合计占总离子色谱图面积的91.4%。按洗脱顺序，峰A为烯丙基异硫氰酸酯（18.6%相对面积）、峰B为3-丁烯腈（4.7%）、峰C为苄基异硫氰酸酯（12.4%）、峰D为二烯丙基二硫化物（3.5%）、峰E为strophanthidin（4.2%）、峰F为棕榈酸（5.9%）、峰G为硬脂酸（3.1%）、峰I为油酸（7.3%）、峰J为亚油酸（9.8%）、峰K为亚麻酸（11.2%）、峰H为evomonoside（6.7%）、峰L为芥酸（14.7%）、峰M为helveticoside（8.3%）。erysimoside（分子量696.78 Da）是14种化合物库中唯一在所采用GC-MS条件下未检出的化合物。

3. 播娘蒿化合物的ADME筛选。 14种化合物库化合物经admetSAR 3.0按预设多参数阈值筛选后，仅3种化合物（evomonoside、helveticoside和strophanthidin）满足全部阈值并进入对接研究。其余11种化合物因一项或多项标准不合格而被排除：erysimoside（分子量、TPSA、HBA、HBD不合格）；6种脂肪酸（全部因logP和HIA不合格，硬脂酸、芥酸和棕榈酸另有PPB不合格）；苄基异硫氰酸酯（Ames、CYP3A4）；烯丙基异硫氰酸酯（Ames）；二烯丙基二硫化物（Ames、CYP3A4）；3-丁烯腈（HIA、P-gp）。

4. 分子对接。 全部12种具有可用三维结构的化合物库化合物均对DNA旋转酶A（PDB: 5ZTJ）进行了对接。莫西沙星和吉米沙星在相同条件下对接，恢复了已发表的旋转酶A-氟喹诺酮结构中的关键残基SER185、LEU32、VAL34和ARG31。三种ADMET优先先导化合物的结合亲和力为：helveticoside ?9.7 kcal/mol、evomonoside ?9.5 kcal/mol、strophanthidin ?8.5 kcal/mol，而莫西沙星为?7.9 kcal/mol、吉米沙星为?8.2 kcal/mol。其余9种对接化合物中，erysimoside得分最高（?10.0 kcal/mol），其他8种得分介于?3.0至?5.2 kcal/mol之间（脂肪酸为?4.4至?5.2 kcal/mol）。erysimoside在ADMET阶段已被排除且未被GC-MS检出。

5. DNA旋转酶A-helveticoside复合物的分子动力学模拟。 排名最前的ADMET合格先导化合物helveticoside（?9.7 kcal/mol）与DNA旋转酶A的复合物经50 ns模拟。蛋白骨架RMSD约15 ns后趋于平衡，此后在约2.2–2.5 ?范围内波动。配体RMSD在前约15 ns经历调整阶段后维持在约1.8 ?，瞬时波动不超过2.1 ?，配体未从结合口袋解离。回转半径平均约3.22 nm，变化很小。残基水平RMSF在环区和末端较高，在接触配体的残基中较低。12个残基（ARG31、VAL184、SER185、LEU186、ILE187、VAL235、GLY236、ALA237、VAL238、LEU287、GLN288和ARG289）在超过95%的模拟帧中与配体保持接触，包括疏水、氢键和静电相互作用。径向分布函数显示配体周围2–5 ?处极性和非极性基团均有一壳层富集，随后出现明确的溶剂化壳层。12个持续接触残基中有6个（ARG31、VAL184、SER185、LEU186、VAL238和GLN288）也属于helveticoside对接构象的相互作用残基集，包括氢键残基SER185和GLN288；ILE187、VAL235、GLY236、ALA237、LEU287和ARG289为模拟中才观察到的额外接触残基。对接中的氢键残基LEU32和VAL34不属于持续接触残基。

6. 提取物理化性质表征。 水醇种子提取物经三次重复制备，平均得率3.72±0.04%（每次157 g原料分别获得5.84、5.78和5.89 g）。提取物为深绿棕色半固体膏状物，具有刺激性、轻微硫磺气味。与乙醇和甲醇完全混溶，在水和丙酮中部分溶解，在己烷和氯仿中不溶。pH为4.0，比重为0.90，鞣质和强心苷检测呈阳性。按OECD指南404进行的皮肤斑贴试验中，24小时后未观察到皮肤刺激。

7. MDR伤寒沙门菌的分离与鉴定。 从伤寒阳性患者血液样本中在SS选择性琼脂上分离出伤寒沙门菌，24小时37°C培养后菌落呈淡色、半透明、H?S阴性，直径1–2 mm。全部5株分离株（MDR-ST1至MDR-ST5）均对氯霉素、氨苄青霉素和复方新诺明耐药，因此被归类为MDR。其中2株（MDR-ST2和MDR-ST4）还对头孢曲松耐药，1株（MDR-ST3）对阿奇霉素耐药。按CLSI 2023判定标准，全部5株分离株对环丙沙星、莫西沙星和吉米沙星敏感。

8. 体外抗菌活性（纸片扩散法）。 提取物在所测试的每个浓度下均抑制全部5株MDR伤寒沙门菌分离株。合并平均抑菌圈（ZOI）为：25 mg/mL时11.5±0.7 mm，50 mg/mL时14.2±0.9 mm，75 mg/mL时15.8±1.1 mm，100 mg/mL时17.15±1.3 mm；50 mg/mL及以上浓度时所有分离株的抑菌圈均≥13 mm。双因素混合效应方差分析（浓度固定效应、分离株随机效应）显示浓度效应显著（F(3, 12)=89.3，p<0.001），分离株效应也显著（p<0.05），Tukey HSD比较显示四个浓度彼此间均有显著差异（p<0.05）。阳性对照的ZOI为莫西沙星19.3±0.9 mm、吉米沙星22.75±1.2 mm。由于对照纸片为自制（20 μg/药片），CLSI判定标准仅适用于标准纸片含量，因此对照ZOI未作敏感或耐药解释；且因提取物为未分级混合物而对照为纯化合物，提取物-抗生素抑菌圈直径仅作描述性报告，不构成效力比较。

9. MIC和MBC测定。 采用肉汤微量稀释法（CLSI M07）测定提取物对全部5株MDR分离株的MIC和MBC。几何平均MIC为8.4 mg/mL（范围6.25–12.5 mg/mL），所有分离株的MBC/MIC比值均为2，符合杀菌活性标准（比值≤4）。

10. FTIR光谱分析。 FTIR光谱显示与提取物主要成分类别一致的功能基团特征。

四、讨论与结论

分子对接与分子动力学模拟共同提出假设：强心苷成分对DNA旋转酶A的抑制可能有助于提取物的抗菌效应。MD模拟支持所预测的helveticoside结合模式的结构稳定性，但并未证明酶抑制活性，且提取物中的脂肪酸和异硫氰酸酯也可能有所贡献。三种ADMET优先强心苷的预测结合亲和力均高于两种参照氟喹诺酮药物，且MD模拟证实helveticoside在动态溶剂化环境中保持稳定结合。体外实验证实该粗提物在高浓度下对MDR伤寒沙门菌表现出杀菌活性，GC-MS确认了化合物库中除erysimoside外的全部13种化合物。该研究提供了一个可检验的机制假说，需通过生物活性导向分级、纯化合物测试及靶点结合实验加以验证。总体而言，该研究为播娘蒿作为抗MDR伤寒沙门菌候选药物来源提供了假设层面的机制依据和实验抗菌证据，为应对多重耐药伤寒的公共卫生挑战提供了新的植物药物研发思路。