海参肽/石榴皮多酚纳米颗粒的“一锅法”绿色合成及其活性氧清除与脂肪积累缓解作用

《Marine Life Science & Technology》：“One-pot” green synthesis of sea cucumber peptide/pomegranate peel derivative nanoparticles with good scavenging of reactive oxygen species and alleviating fat accumulation

　　

将占果实重量20%–30%的石榴皮作为农业废弃物进行填埋处理的常见做法，导致了显著资源浪费并加剧了环境挑战。与“毫无价值”相反，越来越多的证据证实，石榴皮是生物活性化合物的宝贵来源，尤其是石榴皮多酚（pomegranate peel polyphenols, PPP）。在本研究中，研究人员直接从粗石榴皮提取物中合成纳米颗粒，以提高PPP的利用率。制备过程涉及将新鲜石榴皮溶液与香兰素和海参肽（sea cucumber peptide, SCP）混合，随后收集所得沉淀，获得基于PPP的纳米颗粒（PPP–SCP NPs）。值得注意的是，PPP–SCP NPs的绿色合成无需有机溶剂和有毒交联剂，从而提高了其生物相容性和潜在规模化能力。优化后的PPP–SCP NPs表现出约268 nm的较小水合粒径和0.299的多分散指数（polydispersity index, PDI），表明其具有良好的胶体稳定性。PPP–SCP NPs中多酚的回收率约为30%。多酚的主要类型为黄酮类化合物（47.52%），其次为酚酸类（33.07%）和单宁类（10.89%）。在体外实验中，PPP–SCP2 NPs有效缓解了H₂O₂诱导的RAW 264.7细胞线粒体功能障碍，并减少了油酸诱导的HepG2细胞脂质积累。尽管抗氧化和脂质调节活性仅在体外进行评估，本研究证明了将果皮废弃物转化为功能性纳米颗粒，从而提供了一种可持续的循环经济理念，值得进一步的体内验证。

石榴皮占果实鲜重的20%–30%，加工中常被当作废弃物丢弃，造成资源浪费和环境压力。然而，石榴皮富含多种生物活性化合物，尤其是石榴皮多酚（pomegranate peel polyphenols, PPP），具有调节细胞氧化还原平衡和降脂等作用。但多酚的水溶性差、生理条件下不稳定、胃肠道吸收有限且代谢排泄迅速，导致其体内生物利用度低。传统提取和加工方法往往需要大量有机溶剂，可持续性差且存在安全隐患。纳米技术被认为是提高活性物质生物利用度的有效策略，但常规纳米合成需要使用苛刻化学试剂或有机溶剂，存在残留毒性、环境可持续性和生物相容性问题。因此，开发安全、可持续、环境友好的“绿色合成”方法，并精确控制纳米颗粒尺寸，成为研究热点。海参肽（sea cucumber peptide, SCP）具有抗氧化、抑制胰脂肪酶等生物活性，香兰素是食品工业重要风味化合物且可作为Mannich反应连接体。研究人员由此设想，以PPP为功能核心和天然稳定剂，通过一锅法绿色合成食品级、尺寸可控的PPP–SCP纳米颗粒（PPP–SCP NPs），实现抗氧化与降脂双重功能。

研究人员将新鲜石榴皮水溶液与香兰素和SCP混合，通过Mannich反应自组装形成PPP–SCP NPs，无需有机溶剂和有毒交联剂。优化后的PPP–SCP2 NPs水合粒径约267.9 nm，PDI为0.299，多酚回收率约30%。多酚组成以黄酮类（47.52%）为主，其次为酚酸类（33.07%）和单宁类（10.89%）。体外实验显示，PPP–SCP2 NPs能够清除H₂O₂诱导的活性氧（reactive oxygen species, ROS），恢复线粒体膜电位，并显著减少油酸诱导的HepG2细胞脂质积累。该研究将果皮废弃物转化为功能性纳米颗粒，为可持续循环经济提供了新概念，并需要进一步体内验证。

关键方法包括：以山东枣庄软籽甜石榴鲜皮制备水提液，海参肽（SCP）由大连深蓝肽科技研发有限公司提供（分子量200–2000 Da，纯度>90%）。将石榴皮溶液与不同比例香兰素和SCP混合，25 ℃避光搅拌24小时，离心收集沉淀冻干，制得PPP–SCP NPs；通过调节三组分浓度控制粒径。采用扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）观察形貌，Malvern Zetasizer测定粒径/PDI/ζ电位，傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）和荧光光谱分析结构，超高效液相色谱-串联质谱（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS）鉴定多酚类型。抗氧化评估采用DPPH、ABTS、铁还原力和·OH清除法；稳定性考察pH 2–8、37–90 ℃热处理和30天储存。细胞实验使用RAW264.7和HepG2细胞，通过MTT法、活/死染色、DCFH-DA探针、JC-1染色和油红O染色检测细胞活力、ROS、线粒体膜电位和脂质积累。

（一）制备与表征（Preparation and characterization）
通过改变SCP、香兰素或PPP浓度，纳米颗粒粒径得到精确调控。当PPP浓度为0.32 mg/mL、香兰素为12 mg/mL、SCP为0.825 mg/mL时，PPP–SCP2 NPs粒径最小，为267.9±12.6 nm，SEM确认其球形形貌。所有配方均带负电荷，有利于胶体稳定和细胞摄取。FTIR显示PPP苯环特征峰消失并出现763 cm^?1、731 cm^?1新峰，提示亚甲基桥形成，表明Mannich反应发生；SCP在形成纳米颗粒后荧光被猝灭，说明SCP参与了组装。

（二）多酚类型（Types of polyphenols）
UPLC-MS/MS分析显示，PPP–SCP2 NPs中多酚以黄酮类（47.52%）为主，酚酸类（33.07%）和单宁类（10.89%）次之。主要黄酮为木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷，主要酚酸为苯甲酸衍生物，主要单宁为鞣花酸-4-O-葡萄糖苷。

（三）抗氧化能力（Antioxidant capacity）
DPPH、ABTS、铁还原力和·OH清除实验表明，PPP–SCP2 NPs具有浓度依赖的抗氧化活性，其中·OH清除能力优于阳性对照维生素C，IC₅₀为329.19±21.72 μg/mL。

（四）理化稳定性（Physicochemical stability）
在pH 2–8范围内，PPP–SCP2 NPs在酸性条件下（pH 2–4）因电荷中和发生可逆聚集，浊度和粒径增加，但pH 5–8下恢复分散，且各pH下DPPH清除活性保持稳定。在37–90 ℃热处理过程中，纳米颗粒保持球形形貌和抗氧化活性；室温储存30天后外观和粒径无明显变化。

（五）生物相容性（Biocompatibility）
MTT和活/死染色显示，PPP–SCP2 NPs对RAW264.7细胞在高浓度（≥400 μg/mL）时降低活力并增加PI阳性细胞，但未诱导ROS升高，说明该效应并非氧化应激所致；对HepG2细胞活力有促进作用，体现较好的细胞相容性。

（六）清除ROS与调节线粒体膜电位（Scavenging of ROS and regulation of the mitochondrial membrane potential）
在H₂O₂诱导RAW264.7细胞氧化应激模型中，PPP–SCP2 NPs浓度依赖性地降低细胞内ROS水平，并通过恢复JC-1红色/绿色荧光比值，缓解线粒体膜电位下降，保护线粒体功能。

（七）对油酸诱导HepG2细胞的降脂作用（Lipid-lowering effects on oleic acid-induced HepG2 cells）
1 mmol/L油酸诱导HepG2细胞脂质蓄积后，PPP–SCP2 NPs处理以浓度依赖方式减少油红O染色面积约40%–60%，表明其具有缓解肝细胞脂肪积累的活性。

讨论部分指出，PPP–SCP NPs的尺寸受三组分浓度平衡调控，负表面电荷有利于稳定性；FTIR和荧光数据支持Mannich反应形成的交联结构。多酚组成分析将抗氧化和降脂活性归因于黄酮类、酚酸类和单宁类的协同作用，其中木犀草素-7-O-β-葡萄糖苷和鞣花酸衍生物是关键活性成分。稳定性实验表明，三元交联网络赋予纳米颗粒抵抗胃肠道pH、热处理和储存的能力。生物相容性存在细胞类型特异性：吞噬细胞在过高浓度下因过度摄取而活力下降，而肝实质细胞表现出增殖或保护效应。ROS清除和线粒体膜电位恢复实验提示，纳米颗粒可通过中和过量ROS保护线粒体完整性。降脂实验表明，脂质积累的减少是真正的生物学效应而非细胞毒性所致。总之，研究人员认为PPP–SCP2 NPs是兼具抗氧化和降脂活性的食品级纳米平台。

本研究成功开发了绿色、食品级、尺寸可调的海参肽和石榴皮多酚纳米颗粒，以克服传统多酚提取和递送的关键局限性，同时增强抗氧化和降脂生物活性。纳米颗粒通过简单、绿色、无需有机溶剂的方法制备。石榴皮多酚既作为功能载荷又作为天然稳定剂，无需合成交联剂或有毒试剂。通过调节石榴皮多酚、香兰素和海参肽的浓度，实现了纳米颗粒尺寸的精确控制，获得粒径约200–600 nm且PDI低于0.4的颗粒。具体而言，优化后的PPP–SCP2 NPs的羟基自由基清除IC₅₀为329.19±21.72 μg/mL，优于维生素C。此外，这些纳米颗粒以浓度依赖方式减少了油酸诱导的HepG2细胞脂滴积累约40%–60%。基于这些发现，将PPP–SCP2 NPs直接用作降脂饮料、抗氧化膳食补充剂的功能成分，或用作乳化食品体系（如沙拉酱、乳制品）的稳定剂，有望预防氧化酸败并改善营养特性。研究人员成功地将石榴皮这一食品工业废弃物转化为高附加值营养产品。尽管其功效已在体外得到证明，但体内性能仍需评估，并可探索与其他生物活性脂质的协同组合以应用于代谢综合征。