大麻二酚通过调控凋亡与自噬相关通路抑制顺铂耐药性头颈鳞状细胞癌的肿瘤相关行为

《Medical Oncology》：Cannabidiol impairs tumor-associated behaviors and modulates apoptosis- and autophagy-related pathways in cisplatin-resistant head and neck squamous cell carcinoma

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）因复发、转移及对常规治疗耐药而始终构成临床挑战，尤其在人类乳头瘤病毒阴性（HPV-negative）肿瘤中更为突出。大麻二酚（CBD）作为一种无精神活性的植物大麻素，已在多种癌症模型中显示出抗肿瘤活性；然而，其在化疗耐药性HNSCC中的作用尚未充分明确。本研究在顺铂（CIS）耐药、HPV阴性的HNSCC模型中评估了CBD的抗肿瘤效应及其细胞机制。研究人员采用MTT法与选择性指数分析，在HN13细胞中评估CBD的细胞毒性作用，并与成纤维细胞及角质形成细胞进行比较。研究人员进一步评估了细胞迁移、侵袭、基质金属蛋白酶活性、克隆形成存活率及三维（3D）球体细胞毒性。通过吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染色及凋亡、自噬和细胞周期调控相关蛋白的Western blot分析，研究了细胞死亡相关机制。研究人员还利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型及HET-CAM实验评估了抗肿瘤活性和血管安全性。通过联合指数分析评估了CBD与CIS的联合效应。结果显示，CBD对HN13细胞表现出选择性细胞毒性，并降低其迁移、侵袭、基质金属蛋白酶-2/9（MMP-2/9）活性、克隆形成存活率及3D球体生长。CBD改变了与凋亡、自噬及细胞周期调控相关的蛋白表达。使用3-甲基腺嘌呤（3-MA）进行药理学抑制可增强CBD相关的凋亡信号，增加PARP和caspase-3的裂解。在CAM模型中，CBD在不引起血管刺激的情况下降低了肿瘤生长和血管面积。此外，CBD与CIS在HN13细胞中表现出协同细胞毒性效应。综上，CBD对CIS耐药的HN13 HNSCC细胞产生选择性抗肿瘤作用，影响肿瘤相关行为并调控凋亡与自噬相关信号，且与顺铂具有协同作用。这些发现支持进一步开展临床前研究，探索CBD作为HNSCC（尤其化疗耐药情境下）潜在辅助治疗手段的价值。

一、研究背景与意义

头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，来源于口腔、鼻窦、咽、喉及唾液腺的黏膜上皮。尽管手术、放疗和系统治疗不断进步，HNSCC的5年总生存率仍徘徊在50%左右，反映出其侵袭性强、复发率高和转移潜力大的特点。HNSCC根据人类乳头瘤病毒（HPV）感染状态可分为生物学和临床上截然不同的亚型。HPV阳性（HPV+）肿瘤由病毒癌蛋白E6和E7驱动，促进p53、Bax、pRb和端粒酶等关键细胞调控因子的功能降解，使基因受损细胞逃避死亡并失控增殖。相比之下，HPV阴性（HPV?）肿瘤主要与烟草和酒精的长期暴露相关，导致TP53突变、DNA加合物形成、异常甲基化和基因组不稳定性累积，预后更差、治疗反应更差。

HNSCC的标准治疗包括手术、放疗和以铂类为基础的化疗，常与5-氟尿嘧啶联用。然而，这些方案常受限于治疗耐药和全身毒性，包括胃肠道紊乱、肾毒性、免疫抑制和生活质量下降。对于不可切除、复发或转移性疾病，西妥昔单抗和帕博利珠单抗等靶向治疗和免疫检查点抑制剂已进入临床实践，但获益仍受不良反应、耐药和高成本限制。因此，亟需替代或辅助治疗策略，尤其在化疗耐药的HNSCC中。

大麻二酚（CBD）是源自大麻的无精神活性植物大麻素，已因其药理特性受到广泛关注。与Δ9-四氢大麻酚（THC）不同，CBD缺乏精神活性且安全性更优。已有研究显示CBD在多种肿瘤模型中具有抗增殖、抗血管生成、抗侵袭和抗迁移作用，可作用于大麻素受体1型（CB1）和2型（CB2）、瞬时受体电位香草酸（TRPV）通道、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和G蛋白偶联受体55（GPR55）等多个分子靶点。然而，针对HPV阴性和化疗耐药HNSCC的CBD研究仍十分有限，尤其是CBD在顺铂（CIS）耐药HNSCC模型中的作用及其对肿瘤相关行为和体内肿瘤生长的影响尚未充分表征。本研究旨在CIS耐药、HPV阴性的HN13 HNSCC模型中评估CBD的抗肿瘤效应及细胞机制，聚焦迁移、黏附、金属蛋白酶活性和克隆形成存活等肿瘤相关行为，以及体外细胞死亡相关机制，并利用CAM模型评估抗肿瘤活性和血管安全性，同时体外评估CBD与CIS的联合效应。

二、主要技术方法

研究人员使用了人HPV阴性HNSCC细胞系HN13（舌）和FaDu（下咽），以及正常人肺成纤维细胞WI38和角质形成细胞HaCaT。HN13和FaDu细胞系由巴西Barretos癌症医院的Rui Manuel Reis教授提供，HaCaT细胞由巴西米纳斯吉拉斯联邦大学的Miriam Teresa Paz Lopes教授提供，WI38细胞由巴西圣若昂德尔雷伊联邦大学的Leandro Augusto de Oliveira Barbosa博士提供。主要技术方法包括：MTT法测定细胞活力并计算半数抑制浓度（IC₅₀）和选择性指数（SI）；划痕愈合实验评估迁移；Transwell小室结合Matrigel评估侵袭；明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（MMP）活性；克隆形成实验评估长期增殖能力；悬滴法生成三维（3D）球体并评估生长；吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）荧光染色评估细胞死亡形态；Western blot检测凋亡、自噬和细胞周期相关蛋白；单丹磺酰尸胺（MDC）染色评估自噬泡；CompuSyn软件进行联合指数（CI）分析评估协同效应；鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型评估体内肿瘤生长和血管参数；HET-CAM实验评估血管刺激性。

三、主要研究结果

3.1 CBD降低HPV阴性HNSCC细胞系的活力、侵袭和迁移

MTT实验显示，CBD在1–50 μM浓度范围、24小时处理下以浓度依赖性方式降低HN13和FaDu细胞活力，IC₅₀分别为10±1.42 μM和14.3±2.27 μM。HN13对CBD更敏感，被选用于后续实验。在正常人成纤维细胞WI38和角质形成细胞HaCaT中，CBD的IC₅₀分别为27.8±4.85 μM和29.5±3.97 μM，而HN13在相同条件下为10±2.59 μM。作为参考，CIS在5–65 μM浓度范围、24小时处理下，HN13、WI38和HaCaT的IC₅₀分别为64.7±8.31 μM、114.2±7.78 μM和25.7±2.20 μM，表明HaCaT对CIS比HN13更敏感。

3.2 CBD对肿瘤细胞具有优先细胞毒性

选择性指数（SI）计算显示，CBD对HN13细胞相对于正常细胞具有优先细胞毒性（WI38/HN13的SI=2.7，HaCaT/HN13的SI=2.8）。相比之下，CIS的选择性较低（WI38/HN13的SI=1.7），且对HaCaT具有显著细胞毒性（SI=0.3），与其在上皮细胞中有限的选择性一致。

3.3 CBD抑制HN13细胞的侵袭和迁移

Transwell侵袭实验显示，10 μM CBD处理24小时后显著抑制HN13细胞侵袭（p=0.0139）。划痕愈合实验中，CBD处理组在24小时后伤口闭合显著减少（p=0.0019），抑制作用持续至48和72小时（p<0.0001）。72小时后，CBD处理组保留了约66%的初始伤口面积，而对照组几乎完全闭合。

3.4 CBD降低MMP-2和MMP-9活性并抑制克隆形成和3D球体存活

明胶酶谱分析显示，10 μM CBD处理显著降低明胶溶解活性，包括pro-MMP-9（降低57%，p=0.0003）、MMP-9（降低77%，p=0.0013）和MMP-2（降低45%，p=0.0129）。克隆形成实验中，CBD处理使集落形成减少98%（p<0.0001），表明长期增殖能力受到强烈损害。在3D球体培养中，对照组球体面积在72小时后增加，而CBD处理抑制了生长，显著减小球体面积（p=0.0131）。

3.5 CBD诱导细胞死亡相关的形态学变化

AO/PI染色显示，CBD处理的细胞出现细胞收缩、染色质凝聚、膜出泡、核碎裂和酸性囊泡结构等细胞死亡相关形态特征。定量分析显示，活细胞显著减少（6%，p<0.0001），早期细胞死亡增加（83%，p<0.0001），晚期细胞死亡增加（8%，p=0.0253）。

3.6 CBD调节细胞死亡和细胞周期相关蛋白

Western blot分析显示，CBD处理增加LC3表达（193%，p<0.0001）和Beclin-2表达（139%，p=0.0049），表明自噬相关蛋白受到调节。CBD还降低caspase-8和cleaved caspase-8，提示外源性凋亡信号受到调节。同时观察到cleaved caspase-3增加和PARP调节。此外，CBD降低cyclin D1表达（76%，p=0.0423）和p53表达（74%，p=0.0484），支持细胞周期调控的参与。

3.7 药理学抑制自噬相关信号增强CBD在HN13细胞中的细胞毒性和凋亡反应

MDC染色显示，10 μM CBD处理12小时后出现蓝色荧光自噬泡。3-MA在HN13细胞中处理12小时的IC₅₀为11.5 mM，研究人员选择了保持75%细胞活力且具有统计学显著差异的最低浓度3 mM。CBD与3-MA联合处理降低了自噬相关信号，与单独CBD相比显著降低细胞活力（p=0.0280）。蛋白表达分析显示，与单独CBD相比，CBD加3-MA组LC3-II表达显著降低，PARP和caspase-3裂解增加。这些发现表明，自噬相关信号可能在HN13细胞中对CBD处理起细胞保护作用，因为3-MA的药理学抑制与LC3-II水平降低和凋亡信号增强相关。

3.8 CBD与CIS在HN13肿瘤细胞中表现出协同效应

在联合实验中，研究人员在扩展浓度范围（5–150 μM）内重新评估了CIS对HN13细胞的细胞毒性，IC₅₀约为76 μM。采用两种联合策略：CBD的IC₅₀与CIS剂量反应曲线各浓度联合，以及CIS的IC₅₀与CBD剂量反应曲线各浓度联合。最佳协同组合为CIS-CBD1（CI=0.6，CIS 5 μM联合CBD 10 μM）和CIS-CBD2（CI=0.8，CIS 25 μM联合CBD 10 μM）。CI值<1、=1和>1分别表示协同、加性和拮抗效应。

3.9 CBD在体内降低肿瘤生长和血管面积且不引起血管刺激

在CAM模型中，CBD显著减小肿瘤大小（p=0.0093），并降低肿瘤周围血管面积（p=0.0202），而连接数和血管长度无显著变化，提示对血管密度的选择性作用。HET-CAM实验中，CBD未引起出血、血管溶解或凝血，被分类为几乎无刺激性（IS=0.57±1.11），与阴性对照和溶剂对照（IS=0.07±0）相当。相比之下，1% SDS产生强烈刺激反应（IS=18.79±0.40）。

四、讨论与结论

讨论部分指出，CBD在多种肿瘤类型中具有潜在抗癌活性。本研究中CBD的10 μM浓度约相当于3145 ng/mL，高于人体口服CBD后报告的血浆浓度，但Go等人已证明5 mg/kg剂量的CBD可抑制FaDu HNSCC细胞异种移植小鼠的肿瘤生长。CBD相比CIS具有更高的肿瘤细胞选择性指数，而CIS对正常角质形成细胞表现出明显毒性，提示CBD可能比常规化疗具有更有利的选择性谱。CBD显著抑制HN13细胞的迁移、侵袭和克隆形成能力，并降低MMP-2和MMP-9的明胶溶解活性，这些酶在细胞外基质降解、侵袭和血管生成中发挥核心作用，提示CBD可能下调与转移进展相关的重要细胞过程。3D球体培养比2D培养具有更接近肿瘤的细胞间相互作用、缺氧区域和治疗耐药谱，CBD在72小时内抑制球体生长。形态学分析和蛋白表达结果表明，CBD诱导与凋亡和自噬相关的细胞死亡特征，增加LC3和Beclin-2表达，降低caspase-8和cleaved caspase-8，增加cleaved caspase-3并调节PARP，同时降低cyclin D1和p53表达。研究人员指出，自噬通量未被直接评估，这些发现不应被解释为自噬通量增加或自噬性细胞死亡的确定证据。3-MA的药理学抑制导致CBD处理后细胞活力进一步降低以及PARP和caspase-3裂解增加，提示自噬相关反应可能在HN13细胞中起细胞保护作用。CBD与CIS的联合表现出协同细胞毒性，可能允许降低CIS剂量同时维持细胞毒性疗效。CAM模型显示CBD显著减小肿瘤大小并降低血管面积，HET-CAM实验显示CBD不引起血管刺激，支持其良好的安全性。

结论部分指出，本研究提供了临床前证据，表明大麻二酚（CBD）在本研究评估的HPV阴性HNSCC模型中发挥选择性抗肿瘤作用。CBD降低肿瘤细胞活力，损害迁移、侵袭和克隆形成能力，调节基质金属蛋白酶活性，减小3D球体面积，并与体外凋亡和自噬相关信号通路的调节相关。此外，CBD与化疗药物CIS具有协同作用。在体内，CBD在绒毛尿囊膜模型中降低肿瘤生长和血管面积，且不引起血管刺激。这些发现支持CBD作为HNSCC（尤其化疗耐药情境下）进一步研究的潜在候选药物。然而，需要利用哺乳动物模型和三维肿瘤系统进行更多研究，以验证CBD单独及与CIS联合的疗效和安全性，并进一步阐明其作用机制、受体参与和转化潜力。