《Journal of the Egyptian National Cancer Institute》：Adjuvant selection and optimization in the design of an epstein–barr virus–based multi-epitope vaccine against Burkitt lymphoma
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摘要
背景：本研究旨在利用免疫信息学方法，筛选并优化针对EB病毒（Epstein–Barr virus，EBV）相关伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）的多表位疫苗构建体，重点关注佐剂的筛选与优化。
方法：研究人员基于gp350、EBNA1、
摘要
背景：本研究旨在利用免疫信息学方法，筛选并优化针对EB病毒（Epstein–Barr virus，EBV）相关伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）的多表位疫苗构建体，重点关注佐剂的筛选与优化。
方法：研究人员基于gp350、EBNA1、LMP2A和BZLF1蛋白来源的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、辅助性T淋巴细胞（HTL）及B细胞表位，依据其预测的免疫学特性进行筛选。研究人员将候选表位组装为不同配置的多表位疫苗构建体，并通过免疫信息学分析对其进行评估。
结果：共有39个CTL表位、21个HTL表位和10个B细胞表位符合预设筛选标准。研究人员构建并比较了5个多表位疫苗构建体（R1–R5）。50S核糖体蛋白L7/L12被选为佐剂，R5因其相对优越的预测三级结构及与Toll样受体2（TLR2）和Toll样受体4（TLR4）的分子相互作用而被确定为最终构建体。R5由790个氨基酸组成，显示出良好的预测抗原性（0.6479）、溶解性、非致敏性和非毒性。其全球预测人群覆盖率高达98.46%。分子对接显示其与TLR2和TLR4具有良好的相互作用，而iMODS分析表明其结构稳定且具有优良的动态特性。免疫模拟预测，在间隔28天进行三次接种后，可诱导细胞免疫和体液免疫应答。
结论：经L7/L12佐剂化的R5构建体在计算机模拟中展现出良好的预测免疫学、结构和分子特性。这些发现支持将其作为针对EBV相关伯基特淋巴瘤的候选疫苗进行进一步实验研究。然而，其实际的免疫原性、安全性和保护效力仍需实验验证。
基于免疫信息学策略的EBV相关伯基特淋巴瘤多表位疫苗设计：佐剂筛选与构建体优化研究解读
一、研究背景与科学问题
伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）是一种起源于生发中心B细胞的侵袭性非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma，NHL）亚型，在非洲中部儿童中高发，且与EB病毒（Epstein–Barr virus，EBV）感染密切相关。在EBV相关的BL中，地方性BL（eBL）亚型的EBV阳性率最高，可达95%。尽管现有EBV疫苗研发已推进至I期和II期临床试验，但多数候选疫苗为靶向主要包膜糖蛋白gp350的预防性疫苗。此类疫苗虽能通过诱导中和抗体阻断EBV进入B细胞，从而有效预防原发感染，但对已建立的潜伏感染，特别是EBV相关恶性肿瘤如BL，获益有限。
BL的肿瘤细胞呈现EBV潜伏I型感染特征，仅持续表达EBNA1一种病毒蛋白。EBNA1虽可通过MHC II类通路被CD4? T细胞识别，但其甘氨酸-丙氨酸重复（GAr）结构域可限制蛋白酶体加工和MHC I类分子呈递，构成重要的免疫逃逸机制。此外，部分EBV阳性BL病例中可检测到LMP2A的表达，其通过激活Ras/PI3K/AKT通路及促进p27Kip1降解等机制，增强MYC驱动的B细胞存活与恶性转化。同时，BL肿瘤中亦存在BZLF1表达及裂解周期激活的证据，提示病毒基因表达程序的异质性。因此，单一靶向gp350的预防策略难以覆盖潜伏感染和肿瘤阶段的免疫需求。
基于上述局限，本研究旨在通过免疫信息学方法，整合EBV不同生命周期阶段（病毒进入、潜伏持续、裂解再激活）的抗原靶点，设计兼具预防和治疗潜力的多表位疫苗。研究特别强调佐剂的筛选与优化，以期提高疫苗的免疫原性、稳定性和持久性，为EBV相关BL的疫苗研发提供新的候选方案。
二、研究设计与技术方法
研究人员从NCBI获取EBV蛋白gp350（P03200）、EBNA1（P03211）、LMP2A（YP_401631.1）和BZLF1（QAC12516.1）的氨基酸序列。主要采用以下关键技术方法开展研究：
- 1.
表位预测与筛选：利用NetMHCpan EL 4.0（IEDB）预测9氨基酸长度的CTL表位，IEDB预测15氨基酸长度的HTL表位，ABCpred预测16氨基酸长度的B细胞表位。所有表位经VaxiJen v2.0、Algpred 2.0、ToxinPred和NCBI BLAST（限定Homo sapiens，taxid: 9606）分别评估抗原性、致敏性、毒性和同源性。HTL表位进一步经IFNepitope、IL4Pred和IL10Pred评估细胞因子诱导能力，B细胞表位经IgPred预测免疫球蛋白类别关联。
- 2.
疫苗构建体组装：将筛选所得表位与三种候选佐剂——OV ASP-1（O16854）、50S核糖体蛋白L7/L12（P9WHE3.1）和人β-防御素-3（Q5U7J2）——通过不同接头（EAAAK、GPGPG、AAY、KK）连接，构建20个构建体并分为5组（R1–R5），末端添加6×His标签。
- 3.
结构与相互作用预测：采用PSIPRED和SOPMA预测二级结构，trRosetta预测三级结构，GalaxyRefine进行结构优化，ProSA、ERRAT和PROCHECK评估结构质量，CABSflex 2.0评估灵活性。利用ClusPro 2.0和HDOCK进行与TLR2（PDB ID: 2Z7X）和TLR4（PDB ID: 4G8A）的分子对接，iMODS进行正态模式分析（NMA）。
- 4.
其他免疫信息学分析：IEDB Population Coverage评估全球人群覆盖率，TAPPred预测TAP分子结合能力，ElliPro分析不连续B细胞表位，IDT工具进行密码子优化（以毕赤酵母Pichia pastoris为表达宿主），SnapGene进行pPICZαA载体克隆，MusiteDeep预测翻译后修饰（PTM），C-IMMSIM进行免疫模拟。
三、研究结果
CTL表位预测：从gp350、EBNA1、LMP2A和BZLF1中分别鉴定出140、57、135和43个满足百分位评分≤0.2、长度9氨基酸且免疫原性≥0的候选表位。经抗原性、毒性、致敏性和同源性筛选后，分别有8、2、27和2个表位合格。
HTL表位预测：从四种蛋白中分别鉴定出122、48、32和62个满足百分位评分≤0.2、长度15氨基酸的候选表位。经综合筛选后，分别有6、2、5和8个表位具有抗原性、非毒性、非致敏性、非同源性且能诱导IFN-γ/IL-4/IL-10。
B细胞表位预测：从gp350、EBNA1、LMP2A和BZLF1中分别鉴定出501、447、170和115个评分≥0.51的候选表位。最终分别有0、7、1和2个表位合格，gp350来源的B细胞表位未获采用。
多表位疫苗构建与筛选：构建20个构建体，经抗原性、致敏性、毒性、理化性质和人群覆盖率评估后，仅含50S核糖体蛋白L7/L12佐剂的构建体（R2、R3、R4、R5）进入后续分析。R1因分子量不在40–110 kDa范围内被排除。
人群覆盖率预测：R1至R5的全球人群覆盖率分别为78.79%、94.39%、97.11%、97.74%和98.46%。覆盖率由HLA-A02系列、HLA-A30:01、HLA-B53:01等I类等位基因及HLA-DRB115:01等II类等位基因共同驱动。
TAP结合能力分析：R5构建体（790氨基酸）中246个氨基酸（31.1%）显示高亲和力，339个氨基酸（42.9%）显示中等亲和力，与其余构建体相当。
结构与验证：trRosetta预测显示所有构建体的TM值未达高质量标准，经GalaxyRefine优化后，ProSA Z-score分别为R2（?5.72）、R3（?5.75）、R4（?6.04）和R5（?5.1），ERRAT和PROCHECK验证表明结构质量良好。
分子对接与构建体选择：ClusPro和HDOCK结果显示R5与TLR2和TLR4的对接评分相对最优。综合抗原性、致敏性、毒性、理化性质、三级结构和受体亲和力，R5被选为最终疫苗构建体。
不连续B细胞表位：ElliPro分析在R5结构中鉴定出18个不连续B细胞表位，评分均高于0.5，最高达0.984。
正态模式分析：iMODS分析显示R5与TLR2复合物的特征值为2.68×10??，与TLR4复合物的特征值为7.69×10??，表明复合物具有良好的结构稳定性。
密码子优化与克隆：针对毕赤酵母优化的基因序列复杂度评分为13.2，经SnapGene克隆至pPICZαA载体（BsaAI和NotI位点），重组质粒大小为5925 bp。
翻译后修饰预测：预测到磷酸化（40）、糖基化（24）、泛素化（14）、羟基化（9）、乙酰化（7）和甲基化（6）位点。
免疫模拟：C-IMMSIM模拟三次间隔28天的注射后，预测产生高浓度IgM及IgG1+IgG2、IgG+IgM升高，同时B细胞、T辅助细胞、细胞毒性T细胞及细胞因子和白细胞介素水平均有所增加。
四、讨论与结论
讨论部分指出，gp350作为预防性抗原靶向病毒进入，而EBNA1、LMP2A和BZLF1作为治疗性靶点分别覆盖潜伏持续、非经典潜伏模式和裂解再激活阶段。OV ASP-1佐剂构建体因预测致敏性被排除，人β-防御素-3构建体未达理想标准。50S核糖体蛋白L7/L12通过结合TLR4激活MyD88和TRIF依赖通路，促进树突状细胞（DC）成熟，驱动CD4?和CD8? T细胞极化，增强IFN-γ分泌和细胞毒性应答。研究强调，对接结果仅反映完整构建体的结构兼容性，而非单一组分的结合证据。PTM预测提示磷酸化可能影响抗原加工，而毕赤酵母特异性糖基化可能不同于天然人类或EBV糖基化，需实验表征。
研究结论指出，含50S核糖体L7/L12佐剂的R5多表位疫苗构建体在抗原性、致敏性、理化与结构特性以及与TLR2和TLR4的预测相互作用方面表现出良好特征。免疫模拟预测三次间隔28天给药后可诱导细胞和体液免疫应答。然而，当前计算机模拟结果不能确立对EBV感染或BL的预防或治疗效果，需通过体外和体内研究进行实验验证，以评估其免疫原性、安全性、抗原加工及潜在的保护或抗肿瘤活性。
