基于AQbD的高效液相色谱法开发、液质联用表征及双变量符合性评估用于注射避孕药中戊酸雌二醇和庚酸炔诺酮的同时测定

《Journal of Pharmaceutical Innovation》：AQbD-Based HPLC Method Development, LC-MS/MS Characterization, and Bivariate Conformity Assessment for Estradiol Valerate and Norethisterone Enanthate in Injectable Contraceptives

本研究旨在开发并验证一种基于分析质量源于设计（AQbD）的高效液相色谱（HPLC）方法，用于同时测定注射避孕药中的戊酸雌二醇（EV）和庚酸炔诺酮（NE），并整合了降解产物的液质联用（LC–MS/MS）表征、测量不确定度评估及双变量符合性评估。研究人员采用实验设计和统计建模对色谱条件进行了系统研究，随后依据ICH Q2(R2)指南进行方法验证。强制降解研究被用于评估色谱方法对降解产物的选择性，主要降解产物通过LC–MS/MS进行了结构表征。优化后的方法展现出令人满意的线性（r2 ≥ 0.9938）、精密度（相对标准偏差 ≤ 3.0%）和准确度（平均回收率为98.4–101.6%）。NE和EV的合成标准不确定度分别为2.1%和2.3%。将这些不确定度纳入符合性评估后发现，当两种活性成分同时进行评估时，传统的针对单个分析物分别控制风险的单变量保护带方法可能无法充分控制总体风险。因此，采用了一种双变量保护带方法，该方法提供了更严格的接受区域，以将总消费者风险控制在约5%。本研究的主要贡献在于将基于AQbD的分析方法开发、降解产物表征、测量不确定度评估以及多参数决策规则整合在一个统一的分析框架内。该策略将分析验证扩展到了传统的性能评估之外，并为多组分药品的符合性判定提供了基于风险的依据。

一、研究背景与问题提出

药品质量不仅关乎疗效，还涵盖产品整个货架期内的化学稳定性，以确保患者安全和法规合规性。含有戊酸雌二醇（EV）和庚酸炔诺酮（NE）的注射避孕药需要可靠的分析方法来分离和定量其活性药物成分（API）及其降解产物。然而，现有文献关于EV和NE降解产物的系统性表征信息有限，特别是缺乏基于统计支持的分析开发策略。此外，药品经常需要对多个分析属性进行同时符合性评估。对于含有EV和NE的注射避孕药，合规性取决于对两种API的综合评估，这构成了一个双变量符合性评估问题。在这种情况下，即使每个参数（EV和NE各自）的特定风险值可接受（低于5%），总的消费者风险也可能显著升高（超过5%）。因此，将不确定度评估、保护带和多参数符合性评估相结合，代表了向更可靠、计量学上更合理的分析决策的重要进步。本研究旨在开发一种简化的AQbD策略，用于开发灵敏且选择性的色谱方法，并整合测量不确定度评估和双变量符合性评估，以解决上述问题。

二、研究内容与结论

研究人员开发并验证了一种基于AQbD的HPLC方法，用于同时测定注射避孕药中的EV和NE。该方法结合了LC–MS/MS对降解产物的结构表征、测量不确定度评估以及双变量符合性评估。研究得出的主要结论包括：优化后的方法具有良好的线性、精密度和准确度；NE和EV的合成标准不确定度分别为2.1%和2.3%；传统的单变量保护带方法在同时评估两种成分时可能无法充分控制总消费者风险，而采用的双变量保护带方法能够提供更严格的接受区域，从而将总消费者风险控制在约5%。

三、关键技术与方法

本研究采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   分析质量源于设计（AQbD）方法：利用实验设计（DoE）和统计建模（如方差分析ANOVA）系统性地研究关键方法参数（CMPs），如梯度变化时间和有机溶剂比例，对色谱保留行为的影响，并建立预测模型以优化色谱条件。
2. 2.
   高效液相色谱（HPLC）：采用配备二极管阵列紫外检测器（UVD）和荧光检测器（FLD）的Agilent Infinity 1260 HPLC系统，在Waters Nova-Pak C₁₈色谱柱上进行分离。其中，FLD用于EV的定量检测，UVD用于NE的定量检测。
3. 3.
   液质联用（LC–MS/MS）：使用离子阱质谱仪（amaZon Speed, Bruker Daltonics）在电喷雾电离（ESI）正负离子模式下，对强制降解实验中产生的主要降解产物进行结构解析和鉴定。
4. 4.
   测量不确定度评估：采用自上而下（top-down）的方法，基于方法验证数据（尤其是回收率和精密度研究）来估计合成标准不确定度（u_c）。
5. 5.
   双变量符合性评估：应用双变量保护带（multivariate guard-band）策略，通过计算双变量覆盖因子（k'=1.95）来确定更严格的多变量接受限，以控制同时评估两种API时的总消费者风险。
6. 6.
   强制降解研究：将样品置于酸、碱、氧化、热（干热和湿热）及光解等应力条件下，以评估方法的专属性及其分离降解产物的能力。

四、研究结果

• •
  分析方法开发（AQbD方法）：通过初步风险评估，识别出有机溶剂比例和梯度变化时间为对准确度和精密度具有高潜在影响的关键方法参数。多因素析因分析显示，流动相组成对保留时间具有统计学显著性。建立的回归模型拟合良好，荧光检测和紫外检测的R²分别达到99.20%和99.04%，能够有效预测不同条件下的色谱行为。
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  耐用性与系统适用性：耐用性测试表明，关键方法参数的微小变动不会影响方法性能，所有系统适用性参数均符合ICH标准。
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  方法验证与测量不确定度评估：方法验证结果表明，该方法在0.1–0.6 μg/mL（NE）和0.01–0.06 μg/mL（EV）范围内线性良好，精密度（重复性和中间精度的RSD均≤3.0%）和准确度（平均回收率98.4–101.6%）均令人满意。通过自上而下法评估，NE和EV的合成标准不确定度分别为2.1%和2.3%。对于NE，回收率和精密度的不确定度贡献占比分别为59%和41%；对于EV，则分别为72%和28%。
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  符合性评估：基于90–110%的规格限，传统单变量保护带方法得到的NE和EV的接受限分别为93.4–106.6%和93.8–106.2%，可将各自的特定消费者风险控制在约5%。然而，考虑到双变量场景，采用双变量保护带方法后，NE和EV的多变量接受限被调整为更严格的94.1–105.9%和94.5–105.5%，从而将总消费者风险控制在约5%。
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  强制降解研究：在酸性、碱性、氧化、热和光解等应力条件下，该方法能够将所有生成的化合物与主峰良好分离，分辨率大于2.0。其中，酸性和碱性水解导致了最显著的降解。
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  降解产物鉴定（LC-MS）：通过LC-MS/MS分析，确认了NE的主要降解产物。在酸性和碱性水解条件下，NE发生酯键断裂，生成的主要降解产物为炔诺酮，其特征碎片离子包括m/z 281.2（脱水）、m/z 257.1（乙炔基断裂）和m/z 121.0（C环碎裂）。

五、总结与结论

本研究成功地将基于AQbD的色谱方法开发、降解产物表征、测量不确定度评估以及双变量符合性评估整合在一个统一的分析框架内。研究结论强调，在同时评估多种成分时，仅控制单个分析物的消费者风险不足以控制整体风险，必须采用多变量保护带策略。该策略通过提供更严格的接受区域，能够有效地将总消费者风险控制在预定水平（约5%）。因此，这种集成化方法将分析方法的开发从传统的性能验证扩展到了基于风险的药品质量决策层面，为多组分药品的合规性判定提供了一个实用且科学的框架。