高分子聚合物辅料用于蛋白质制剂固态稳定化的机制、材料与监管进展

《Journal of Pharmaceutical Investigation》：Polymeric excipients for solid-state stabilization of protein formulations

背景：蛋白基治疗药物（protein-based therapeutics）占FDA批准生物制品（biologics）的相当比例，蛋白模态的持续扩展增加了对有效稳定化策略的需求。尽管固态蛋白制剂（solid-state protein formulations）通常较液体制剂具有更优的储存稳定性，但冷冻干燥（lyophilization）、喷雾干燥（spray drying）和喷雾冷冻干燥（spray freeze-drying）等干燥过程可引入显著的物理和化学应激，从而损害蛋白稳定性。覆盖领域：本综述聚焦高分子量聚合物辅料（high-molecular-weight polymeric excipients）在蛋白基注射剂（protein-based injectable formulations）固态稳定化中的作用。文中讨论干燥及长期储存过程中常见的不稳定性来源，并总结和强调聚合物辅料作为稳定剂日益增长的研究兴趣。讨论聚合物辅料增强蛋白稳定性的机制，包括无定形基质形成（amorphous matrix formation）、分子迁移率降低（reduced molecular mobility）以及针对界面应激（interfacial stresses）的表面活性保护（surface-active protection）。同时考虑当前用于FDA批准注射剂中的聚合物辅料与研究性材料（investigational materials）的监管状态（regulatory status）。专家意见：聚合物辅料（polymeric excipients）为固态蛋白稳定化提供了独特优势，在合理选择时可补充或超越传统低分子量稳定剂（low-molecular-weight stabilizers）。然而，更广泛的采用需要改进机制理解、审慎考虑辅料-蛋白相互作用（excipient–protein interactions）并与监管期望（regulatory expectations）保持一致。预计聚合物辅料的持续开发和系统评价将拓展制剂设计选择，并改善下一代蛋白治疗药物（next-generation protein therapeutics）的稳定性和性能。

引言（Introduction）：生物治疗涵盖疫苗、基因治疗、细胞治疗和治疗性蛋白，治疗性蛋白在批准生物制品中占显著比例，且易在制造、储存和给药过程中降解。蛋白不稳定性包括化学降解（脱酰胺、氧化、糖化）和物理不稳定性（构象扰动、胶体相互作用导致聚集、沉淀或天然结构丧失），受蛋白序列、结构基序、疏水区和化学“热点”等内在因素以及温度、pH、离子强度、机械应力等外在因素影响。固态蛋白制剂通过降低分子迁移率和化学/物理降解敏感性提高稳定性；冷冻干燥（lyophilization）、喷雾干燥（spray drying）和喷雾冷冻干燥（spray freeze-drying）可产生固态产品，但可引入冷变性、界面应激等。蔗糖、海藻糖和甘露醇等传统辅料应用广泛，但结晶和吸湿性可限制长期储存；残余水分作为增塑剂降低玻璃化转变温度（T_g）。聚合物辅料因长链、大体积和高T_g受到关注，可提高基质T_g、降低分子迁移率并抑制低分子量辅料结晶。本综述聚焦聚合物辅料在蛋白干燥和固态稳定化中的机制作用，强调依据蛋白特性、加工应激和长期稳定性需求进行合理设计。

蛋白质制剂干燥过程中的应激因素（Stressors involved in the drying of protein formulation）：冷冻干燥和喷雾干燥使蛋白暴露于多重失稳应激。冷冻过程中可发生冷变性；冰-水界面吸附可导致部分去折叠和界面诱导变性；冷冻浓缩增加溶质浓度、黏度和离子强度，可能加速降解；糖和缓冲盐可能过饱和结晶，降低稳定能力或引起pH偏移。聚合物可通过抑制冰晶生长、抑制低分子量组分结晶和维持均一无形基质缓解冷冻相关应激。脱水步骤（冻干升华或喷雾干燥蒸发）去除水化壳，破坏水介导氢键和质子化状态，改变电荷分布、增强蛋白-蛋白相互作用并导致天然结构和功能丧失。喷雾干燥热应激加速脱酰胺、氧化和水解，促进去折叠和聚集；雾化剪切和空气-液界面使两亲性蛋白吸附并部分去折叠，暴露疏水残基并引发聚集。聚合物通过形成高T_g玻璃态基质限制分子迁移率、以两亲性提供界面保护、形成氢键进行水替代相互作用并降低结晶敏感性。

固态蛋白稳定化原理（Principles of stabilizing protein in the solid state）：辅料稳定干燥蛋白通常涉及水替代、玻璃态基质形成和界面稳定化。脱水破坏三维结构热力学稳定性；水替代假说认为辅料以可及羟基或质子化官能团与蛋白表面极性残基形成氢键，补偿脱水所致稳定相互作用丧失；聚合物因延伸结构可多价相互作用并提供更持久水替代。固态稳定还取决于基质形成（玻璃化）和分子迁移率抑制；有效辅料形成刚性无定形基质，固定蛋白并限制促降解运动，与T_g及储存低于T_g程度相关。α-松弛（α-relaxation）与T_g强相关，在玻璃态减慢；加入聚合物如葡聚糖或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可提高糖基质T_g。β-松弛（β-relaxation）与局部运动和蛋白-辅料相互作用相关，β-松弛时间增加与蛋白保存改善线性相关。表面活性对缓解干燥、储存和复溶界面应激关键；吸附于蛋白表面的辅料可减少蛋白-蛋白和蛋白-空气相互作用，降低空气-水或冰-水界面聚集和变性。聚山梨酯和泊洛沙姆传统上承担此角色；两亲性聚合物如羟丙基-β-环糊精（HPβCD）可提供类似界面保护并贡献基质刚性。并非所有聚合物通过水替代或直接玻璃形成稳定蛋白；大体积多糖如葡聚糖和菊粉可显著提高T_g并降低分子迁移率，但大分子尺寸和位阻可能限制与蛋白表面的紧密缔合和氢键作用。聚合物还可通过静电作用、疏水相互作用和位阻稳定蛋白。二糖仍是基础稳定剂，聚合物已成为可同时针对多种稳定机制的重要辅料类别。

固态蛋白制剂中的聚合物（Polymers in solid-state protein formulations）：文章对用于固态蛋白制剂的聚合物进行分类总结。碳水化合物基聚合物（Carbohydrate-based polymers）：葡聚糖（Dextran）为天然亲水支链多糖，分子量1 kDa至数千kDa，40、70和75 kDa用于FDA批准肠外产品；因提高T_g和形成刚性基质被广泛研究，Mylotarg?含40 kDa葡聚糖。其稳定作用高度依赖分子量、蛋白比、糖化风险和基质混溶性，可稳定某些模型蛋白、提高氧化稳定性，但也有糖化导致单克隆抗体（mAb）聚集、喷雾干燥中促进美拉德反应、相分离和表面蛋白富集等不一致结果；合理选择应优先降低糖化风险、确保无定形基质混溶并与二糖配对，改性葡聚糖可拓展选择但需评估。环糊精（Cyclodextrin）中β-环糊精尤其HPβCD为两亲性环状寡糖，具疏水腔和弱表面活性；固态保护可能涉及高T_g限制迁移率和羟基促进氢键。喷雾干燥中HPβCD与抗体1:3 w/w在120和150°C入口温度稳定一年，200°C则储存稳定性显著下降；曲妥珠单抗1:1 HPβCD优于β-环糊精或海藻糖；近期研究显示HPβCD 1:1 w/w储存稳定性显著优于海藻糖。HPβCD还改善颗粒空气动力学性能；亲水/中性衍生物改善构象和胶体稳定性，阴离子衍生物增加静电排斥抑制自缔合，轻度疏水版本可增强芳香侧链包合但高取代可能失稳。低取代HPβCD在喷雾干燥胰蛋白酶中活性回收84–107%，优于高取代17–55%和葡聚糖40 kDa 62–70%；在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球中优于泊洛沙姆188和聚山梨酯20（PS20），维持胰岛素释放45天；但与聚山梨酯在溶液中可能相分离。冻干中HPβCD与蔗糖或蔗糖+PVP K17联用提高储存稳定性；可提高蔗糖系统T_g′允许更高加工温度；喷雾冷冻干燥（SFD）中高雾化流速下稳定蛋白，低浓度与海藻糖联用保护甲状旁腺激素（PTH）并提高生物利用度；高浓度1:5和1:2.5与海藻糖联用稳定免疫球蛋白G（IgG）。HPβCD需互补辅料增强储存稳定性，人体耐受至470 mg/kg/day，需剂量优化和监管审查。菊粉和普鲁兰（Inulin and Pullulan）：菊粉为果聚糖多糖，亲水，研究多用约1–4 kDa，未用于FDA批准生物制剂但临床用于肾清除测试；还原端可促进美拉德反应，随分子量增加还原基团减少且T_g增加。菊粉可单独或作共辅料，SFD胰岛素中海藻糖+菊粉1:1优于单用；与相似大小葡聚糖6 kDa比较，菊粉4 kDa在冻干和储存中稳定胰岛素、乙肝表面抗原、乳酸脱氢酶（LDH）和β-半乳糖苷酶更优，归因于更高分子柔性促进氢键；但在高糖条件下海藻糖仍优。菊粉+蔗糖6:5 w/w稳定英夫利昔单抗，喷雾干燥中菊粉基配方优于葡聚糖基；IgG冻干中仅低分子量菊粉出现美拉德褐变。菊粉通常不超过海藻糖，但优于相似多糖并可作共辅料。普鲁兰为线性多糖，重复麦芽三糖单元经α-(1→6)糖苷键连接，实际非还原，美国FDA一般认为安全（GRAS）；高水溶性，T_g>200 °C，利于固态稳定；冻干中形成刚性无定形基质保存蛋白结构；喷雾干燥中可单独或与海藻糖生成微粒；但系统评价有限。其他碳水化合物聚合物中，羧甲基纤维素钠（NaCMC）有冻干保护和黏度介导稳定作用但机制不清、高黏度影响加工和复溶；羟乙基纤维素（HEC，约90 kDa）通过基质固定提供稳定但数据有限；羟丙基甲基纤维素（HPMC，约54 kDa）抑制聚集增强基质稳定性但存在相分离和黏度问题；壳聚糖和羧甲基壳聚糖分别主要经包封/静电作用和水溶性改善发挥作用，但证据仍少。表面活性剂基聚合物（Surfactant-based polymers）：泊洛沙姆（Poloxamer）为非离子三嵌段共聚物，中央疏水聚丙烯氧化物（PPO）两侧亲水聚环氧乙烷（PEO）；泊洛沙姆188（P188）最常用，作非离子表面活性剂增强液体制剂稳定性，机制包括与疏水区作用、抑制表面吸附和竞争界面暴露。冻干中P188稳定作用取决于结晶行为、浓度和降解；冻融中可结晶负面影响，蔗糖1:1和1:2抑制结晶；1% w/v P188在冻融中最佳稳定LDH。P188可兼具稳定剂和赋形剂；6个月长期储存中蔗糖:P188 2:1最有效，单独海藻糖或蔗糖导致结构塌陷，单独P188使LDH活性降低8–10倍。高浓度P188 10% w/v在冷冻中引起溶菌酶聚集但融化可逆。P188降解受缓冲液影响，组氨酸缓冲液在冻干和氧化剂暴露中可致降解。喷雾干燥中mAb 75 mg/mL加0.4% w/v P188稳定性与PS20和聚山梨酯80（PS80）相当；P188还改善肽激素粉末流动性。泊洛沙姆407（P407）在喷雾干燥中稳定溶菌酶和胰岛素，并可保护重组人生长激素免受冻融不稳定性；机制可能为优先扩散至空气-水界面屏蔽蛋白。聚山梨酯（Polysorbates）为广泛非离子表面活性剂，多数批准生物制剂含聚山梨酯；PS20和PS80最常用，PS80含油酸更亲脂，PS20含月桂酸疏水性较低。液体制剂中稳定蛋白抗搅拌和表面吸附聚集；冻干中脱水步骤稳定效率有限但有冻干保护，PS20至0.2% w/w在冷冻和退火中保存天然结构，0.04% PS20防止冻融诱导溶菌酶聚集，还防止复溶诱导聚集。喷雾干燥中PS80优于PEG和span，≥0.01% PS80维持α-螺旋和β-折叠，并使表面蛋白暴露降低约50%；但聚山梨酯增塑降低T_g，可酶解或化学降解并促进亚可见颗粒。蛋白基聚合物（Protein-based polymers）：明胶（Gelatin）分子量80–375 kDa，水解明胶0.1–5 kDa，水溶性更高；FDA因安全顾虑撤回所有含明胶静脉产品，但明胶及水解物仍用于FDA批准液体和冻干疫苗（非静脉）。明胶保护蛋白免受雾化应激，通过静电、疏水等作用增强液体热稳定性并减少聚集；可稳定冻干和长期储存噬菌体，并保护寡核苷酸冻干和40°C储存4周。喷雾干燥中水解明胶与NaCMC、葡聚糖20 kDa、HPβCD、海藻糖、甘露醇1:1 w/w比较，水解明胶和HPβCD优于海藻糖或甘露醇，与海藻糖或甘露醇联用进一步改善；但明胶作为固态蛋白稳定生物聚合物仍待深入。白蛋白（Albumin）高水溶性且固有稳定，重组人血清白蛋白（rHSA）已作为稳定剂用于多种上市生物制品；人血清白蛋白（HSA）用于液体和冻干配方，主要经表面活性剂样性质防止表面吸附和聚集。冻干中白蛋白减少甘露醇结晶，维持无定形基质；白蛋白有效需自身结构完整，近等电点HSA可失稳而非保护；其黏度和复溶挑战需考虑。合成聚合物（Synthetic polymers）：PVP为水溶性聚合物，分子量约2.5–1300 kDa，用于FDA批准肠外产品；两亲性和高极性可形成氢键，但主链疏水碳链可能位阻限制直接作用。PVP强基质形成，5% w/w PVP 300 kDa显著提高冻干蔗糖T_g和结晶温度；PVP 24 kDa和HPβCD具有更高塌陷温度，可在更高初级干燥温度玻璃化。冻干中5% w/v PVP使LDH近100%活性回收，2% w/v PVP使天冬酰胺酶完全回收；mAb中HPβCD单独或+PVP 7–11 kDa 25°C 9个月聚集约1%，HPβCD+葡聚糖40 kDa约5%；PVP 25 kDa 1–4% w/v与蔗糖或甘露醇联用。混溶性关键：PVP 40 kDa在NaCl存在下冷冻诱导相分离；4.5% w/w PVP 28–32 kDa抑制甘露醇结晶。SFD中PVP 1300 kDa优于360和55 kDa；喷雾干燥中PVP形成无定形基质和稳定颗粒。总体通过基质形成、结晶抑制和调节分子迁移率而非仅强特异性氢键；效果依赖分子量、浓度、配方组成和离子强度；常与糖或环糊精联用而非单独。共聚维酮在喷雾干燥、冻干和储存中保存溶菌酶活性。PEG为非离子亲水合成聚合物，分子量100 Da–80 kDa，用于FDA批准肠外产品；冻干中PEG 8 kDa在0.75:1摩尔比稳定蛋白，机制为强吸附于疏水核心防止聚集；PEG化是共价连接策略增强溶解度、稳定性、活性和货架期。PEG单独可能不足：1% w/v PEG稳定LDH和磷酸果糖激酶冻融但冻干保护不足，加30 mM海藻糖显著增强，说明PEG经优先排斥稳定但缺乏广泛氢键；位阻限制。低分子量PEG 200、400、600 Da在冻干中对过氧化氢酶有去稳定作用。喷雾干燥中PEG 4000 0.04% w/v稳定牛血清白蛋白（BSA）；低分子量PEG 200–1500 Da促进乳糖结晶和相分离。PVA为线性碳主链带羟基，强亲水和氢键能力，T_g约70–85°C；冻干中较高分子量PVA 35–75 kDa在纳米颗粒中改善胰岛素稳定；PVA 31–50 kDa在冻干胆红素氧化酶中优于葡聚糖平均39 kDa，并在相对湿度23.4%及以上5–24 h优于海藻糖；但PVA 18 kDa稳定血清γ-球蛋白不如葡聚糖40 kDa。喷雾干燥和静电纺丝中PVA表现多变，对分子量、水解度和配方敏感；部分水解PVA与海藻糖联用改善溶菌酶和过氧化氢酶稳定性，支持共辅料角色；PVA 30 kDa在喷雾干燥中未能稳定BSA；超高分子量PVA 130 kDa在静电纺丝及储存中稳定β-半乳糖苷酶。PVA在喷雾基工艺中常为包封剂。新型聚合物（Novel polymers）：近年开发的新型聚合物辅料设计考虑两亲性提供界面保护、高T_g促进刚性基质、可调水溶性实现即时或延长释放、可及羟基促进水替代，并避免还原端以减少美拉德褐变。海藻糖基糖聚合物在冻干和热应激中稳定β-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶优于海藻糖。聚(丙烯酰吗啉-co-N-异丙基丙烯酰胺)（MoNi）在蛋白:辅料20:1 w/w下稳定BSA和人IgG优于海藻糖；微粒含约95% w/w蛋白和仅5% w/w MoNi，却与30% w/w海藻糖配方稳定相当。两亲性嵌段共聚物聚(N-异丙基丙烯酰胺)-聚乙二醇（PNIPAM–PEG）在液体中缓解空气-液界面应激优于聚山梨酯，但干燥和长期储存未评估。超支化聚合物HPOD在冷冻、热应激和冻干中稳定胰岛素、溶菌酶、β-半乳糖苷酶和抗体等于或优于对照。氨基酸基聚合物在冻干中稳定β-半乳糖苷酶，但未与蔗糖、海藻糖或甘露醇直接比较。新型聚合物可降低辅料载量、定制应激特异性保护并拓展设计空间；但未列GRAS或FDA肠外非活性成分数据库，注射剂使用需毒理评价包括免疫原性、生物降解、蓄积和清除。结论（Conclusion）：冻干和喷雾干燥是固态生物制药主要干燥平台；脱水、冷变性和界面应激等已表征，可制定缓解策略。稳定方法演进引入新辅料、现有辅料再利用和多官能辅料。聚合物因多样功能关键，通过玻璃态基质形成和两亲性表面活性剂样行为保护蛋白。优化聚合物稳定策略需理解聚合物浓度、分子量分布、聚合物-蛋白相互作用和固态基质内辅料-辅料相互作用；与二糖或糖醇传统稳定剂策略性联用可协同改善玻璃形成、分子迁移率降低和界面保护。安全与监管至关重要；需评价毒理顾虑、辅料相关不良反应和监管安全限，确保患者安全和合规。