《Journal of Plant Pathology》：Morphological and molecular identification of Magnaporthe oryzae causing finger millet blast disease in Kenya
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指状小米（Eleusine coracana (L.) Gaertn.）是一种未被充分利用但具有气候适应性和优异营养保健特性的谷类作物。它是肯尼亚西部和东部地区大多数小农户女性农民的重要自给作物，种植于低投入混作系统中。限制其生产的挑战之一是稻瘟病（blast
指状小米（Eleusine coracana (L.) Gaertn.）是一种未被充分利用但具有气候适应性和优异营养保健特性的谷类作物。它是肯尼亚西部和东部地区大多数小农户女性农民的重要自给作物，种植于低投入混作系统中。限制其生产的挑战之一是稻瘟病（blast disease），该病由Magnaporthe oryzae（异名Pyricularia oryzae）引起。该研究的目的是鉴定和表征与肯尼亚指状小米稻瘟病相关的M. oryzae分离株。研究人员在七个主要指状小米种植县开展了田间调查，从叶片、穗颈和指状穗收集了450份具有症状的组织样本。利用形态学和分子方法对93个分离株的单孢培养物（monoconidial culture）进行了表征。使用两个不同的分离株对18个指状小米基因型进行了致病性测定。形态学分析将分离株分为两大分支，且与组织类型或地理位置无关。ITS5/4将46个分离株鉴定为M. oryzae，其中28个利用Pot2a进一步验证，另有18个利用Pfh2引物验证。来自穗颈的独特分离株S2_N_BS和来自指状穗的S72_F_HM引发了不同的寄主反应，表明寄主基因型对这两个分离株存在遗传差异。本研究的结果为未来M. oryzae分离株的形态学和分子鉴定提供了知识，并进一步表明存在未来需要表征的不同病理型。
指状小米（Eleusine coracana (L.) Gaertn.）是非洲和亚洲干旱半干旱地区种植的谷类作物，具有优异的营养保健特性，在肯尼亚主要由小农户女性农民在低投入混作系统下种植，但其产量远低于潜力。限制生产的主要生物胁迫之一是稻瘟病（blast disease），由异宗配合子囊菌Magnaporthe oryzae（异名Pyricularia oryzae）引起。该病原菌寄主范围广，可侵染水稻、小麦、谷子等多种禾谷类作物，并依据寄主专化性分为Eleusine（MoE）、Setaria（MoS）、Oryzae（MoO）和Triticum（MoT）等病理型。尽管已有较多关于MoT和MoO的研究，但对肯尼亚及东非地区MoE的鉴定和遗传多样性研究十分有限。早期研究虽揭示了部分肯尼亚西部分离株的寄主适应性，但群体结构尚不明确。为此，研究人员开展了本研究，旨在结合形态学与分子分析（ITS5/4、Pot2a和Pfh2）鉴定肯尼亚主要指状小米产区稻瘟病相关M. oryzae分离株，并通过致病性测定初步探索不同分离株的致病性差异。
研究人员于2019、2021和2022年雨季在肯尼亚Makueni（MK）、Homabay（HM）、Kisii（KS）、Kisumu（MS）、Busia（BS）、Nyamira（NY）和Migori（MG）七个县进行调查，采集450份具典型症状的叶片、穗颈和指状穗样本。通过单孢分离和纯化获得94份培养物（含2个变体）；形态学观察记录菌落形态、颜色、边缘及分生孢子形状和大小；分子鉴定采用真菌通用引物ITS5/4和物种特异性引物Pot2a、Pfh2进行聚合酶链反应（PCR）扩增与Sanger测序，并在MEGA X中构建最大似然系统发育树；致病性测定选用两个分离株对18个指状小米基因型进行离体叶片接种，按1–9级标准评价严重度。
真菌分离与形态学特征：450份样本中仅92份（约21%）成功获得纯培养，表明从田间症状组织分离稻瘟病菌存在困难。形态学聚类将分离株分为两大分支及四个亚簇（1A、1B、2A、2B），其中簇2A形态多样性最高。多数分离株菌落颜色和边缘变异明显，但仅簇1A、1B和2B中的部分分离株具有梨形分生孢子（pyriform conidia），可作为M. oryzae的初步形态特征；孢子长度9.3～19 μm，直径2.1～6.3 μm。
基于ITS5/4的分子鉴定：所有94份培养物均扩增出约567 bp片段，89个成功测序。系统发育分析显示，47个分离株与Magnaporthe属聚类，其中46个明确归入MoE分支，并区别于来自谷子、水稻和小麦的参考序列；其余分离株分别与Epicoccum属（27个）、Curvularia属（6个）、Alternaria属（4个）、Nigrospora属（3个）和Arthrinium属（2个）聚类。MoE分离株未按组织类型或地理来源形成特定聚类。
基于Pfh2的分子鉴定：Pfh2扩增产生约687 bp片段，对30个扩增子测序后，发现其不仅扩增MoE，也扩增了Epicoccum、Curvularia和Alternaria等属真菌，表明Pfh2引物缺乏特异性。该引物共验证了16个此前经ITS5/4鉴定的MoE分离株，但无法将MoE与其他近缘属区分。
基于Pot2a的分子鉴定：Pot2a扩增出389 bp片段，30个测序扩增子中28个与ITS5/4鉴定的MoE结果一致，并额外确认了两个先前存疑的分离株（S65_F和S20_L）为MoE。Pot2a与ITS5/4组合能够有效验证MoE分离株。
肯尼亚MoE分离株的遗传多样性分析：综合至少两个标记确认的44个MoE分离株均为梨形孢子，主要来自形态学簇1。基于ITS5/4和Pot2a的系统发育树显示，MoE分离株内存在多个聚类及潜在变异亚簇，表明肯尼亚MoE群体可能存在遗传分化；Pfh2则无法有效区分这些分离株。
致病性测定：选取分离株S2_N_BS（来自穗颈，Busia县）和S72_F_HM（来自指状穗，Homa Bay县）接种18个指状小米基因型，所有基因型均出现症状，且病斑数、病斑大小和严重度评分存在显著差异（P＜0.001）。其中5个基因型（IE3973、IE5812、IE546、IE6321、IE5635）对两株均表现抗病（R），3个基因型（OKHALE-1、IE501、IE2008）均表现中抗（MR），2个基因型（ICFV182427 KNE741和MS18 IE2187）均表现感病（S）。其余基因型对两个分离株的反应不一致，例如ICFV182512对S2_N_BS感病而对S72_F_HM抗病。这表明两个分离株的致病性存在分化，不同寄主基因型对特定分离株具有不同的抗感性。
讨论指出，形态学特征（尤其是梨形分生孢子）可作为初步筛选依据，但不足以单独准确鉴定MoE，必须结合分子方法。ITS5/4和Pot2a组合适合MoE鉴定，而Pfh2因扩增非靶标真菌而不推荐使用。研究还发现MoE与Epicoccum、Curvularia、Alternaria等真菌在寄主组织上共存，这可能导致症状混淆和分离率低。遗传多样性分析结果提示肯尼亚MoE可能存在多个变异类型，需进一步通过代表性分离株的广泛致病性测试加以确认。不同分离株在寄主上的反应差异表明，未来抗病育种需针对目标区域的优势致病型进行。
结论：该研究证明了从肯尼亚不同指状小米种植县收集的分离株存在形态培养和遗传变异。研究结果对指状小米社区具有重要意义，基于观察到的病原和寄主差异，未来应利用这些信息制定育种策略以管理指状小米稻瘟病。已确认的46个MoE分离株的致病性差异将需作为未来病原进化研究的基础，类似于水稻和小麦等主要作物中的研究方式。
