蕨类植物Neoblechnum brasiliense中塑造酚类化合物谱系的BAHD酰基转移酶功能解析：迷迭香酸生物合成关键酶的鉴定

《Planta》：When ferns go BAHD: characterization of acyltransferases responsible for shaping the phenolic landscape of the fern Neoblechnum brasiliense

　　

主要结论：在积累迷迭香酸的蕨类植物Neoblechnum brasiliense的转录组中检索到47条BAHD酰基转移酶序列。其中一条序列编码的羟基肉桂酰转移酶（hydroxycinnamoyltransferase）能够接受（羟基）苯乳酸（(hydroxy)phenyllactates）作为酰基受体，从而形成迷迭香酸（rosmarinic acid, RA）。

摘要：蕨类植物Neoblechnum brasiliense（乌毛蕨科，Blechnaceae）以积累迷迭香酸及相关酚类化合物而闻名。先前的研究未能鉴定催化羟基肉桂酰基转移至苯乳酸（phenyllactic acid）的酶，而该步骤是迷迭香酸生物合成的关键步骤。研究人员建立了Neoblechnum brasiliense幼嫩与成熟羽片的长读长转录组（long-read transcriptome），从中获得47条转录的BAHD酰基转移酶序列。利用p-香豆酰辅酶A（p-coumaroyl-CoA）和70种假定酰基受体底物对编码的酶进行了催化活性测试。NbHCT10/11/12/13主要接受莽草酸（shikimic acid）和奎宁酸（quinic acid），并与利用相同受体的其他酶一同归入BAHD进化枝V（clade V）。NbHCT19/20作为ω-羟基棕榈酸羟基肉桂酰转移酶（ω-hydroxypalmitic acid hydroxycinnamoyltransferases），聚集在进化枝VI（clade VI）中。NbHCT21/22同样属于clade VI，但表现出不同的底物接受谱。NbHCT22酰化色氨酸（tryptophan），而NbHCT21利用苯乳酸、4-羟基苯乳酸（4-hydroxyphenyllactic acid）和3,4-二羟基苯乳酸（3,4-dihydroxyphenyllactic acid）作为酰基受体，因此具备形成迷迭香酸的酶学能力。NbHCT21的生化表征显示其对p-香豆酰辅酶A和咖啡酰辅酶A（caffeoyl-CoA）具有高亲和力（Km分别为9.2和4.4 μM），但对4-羟基苯乳酸的亲和力较低（Km 3.2 mM）。NbHCT21的系统发育位置表明，能够合成迷迭香酸的酶存在趋同进化。针对作为间位羟化酶的NbCYP98进行的实验表明，p-香豆酰色胺（p-coumaroyltryptamine）及其他三种p-香豆酰酰胺优先被羟化。然而，被羟化的是色胺部分而非p-香豆酰部分，推测形成p-香豆酰-N-血清素（p-coumaroyl-N-serotonin）。研究人员的转录组分析为具有复杂酚类化合物谱的蕨类植物Neoblechnum brasiliense的酚类代谢提供了新的认识，并为未来研究奠定了基础。

论文解读：蕨类植物Neoblechnum brasiliense中BAHD酰基转移酶的功能解析与迷迭香酸生物合成关键酶的发现

迷迭香酸（rosmarinic acid, RA）是一种由咖啡酸衍生物与苯乳酸衍生物缩合形成的酚类化合物，主要存在于唇形科（Lamiaceae）和紫草科（Boraginaceae），但在蕨类植物中也有零星报道。蕨类植物Neoblechnum brasiliense（乌毛蕨科，Blechnaceae）能够积累RA及其相关酚类化合物，如绿原酸（chlorogenic acid）和blechnic acid等。尽管RA生物合成途径在被子植物中已较清楚，但在蕨类植物中催化羟基肉桂酰辅酶A的酰基转移到苯乳酸（phenyllactic acid）的关键酶——羟基肉桂酰辅酶A:羟基苯乳酸羟基肉桂酰转移酶（RAS）——一直未被鉴定。为了解析该蕨类植物酚类代谢的分子基础，研究人员开展了本研究。

研究人员建立了幼嫩和成熟羽片的长读长转录组，鉴定出47条转录的BAHD酰基转移酶序列，其中包含先前已鉴定的NbHCT1-9。通过异源表达和广泛的底物筛选，确定了多个酶的催化功能，其中NbHCT21能够利用苯乳酸、4-羟基苯乳酸和3,4-二羟基苯乳酸作为酰基受体，具有形成RA前体的能力。系统发育分析表明，NbHCT21属于蕨类植物（monilophyte）谱系特异性进化枝，与已知被子植物RAS所在的clade V不同，提示RA合成酶在植物中发生了趋同进化。此外，研究人员还表征了NbCYP98的间位羟化活性，发现其优先羟化p-香豆酰色胺的色胺部分，推测形成p-香豆酰-N-血清素。该研究首次在蕨类植物中鉴定了可能参与RA生物合成的BAHD酰基转移酶，为理解酚类代谢的进化提供了新视角。

主要关键技术方法如下。植物材料取自马尔堡大学植物园（accession号1977/388），采集幼嫩和成熟羽片。提取总RNA，构建Kinnex全长度RNA文库，在PacBio Revio平台进行单分子实时测序。HiFi reads经MAS-Seq条形码策略分段、去多重化，经Skera、Lima和Iso-Seq Refine处理获得全长非嵌合reads，再用Iso-Seq Cluster2聚类获得高质量一致性亚型。利用TransDecoder预测开放阅读框，使用HMMer和MMseqs2搜索BAHD序列。候选基因克隆至pET-15b载体，在大肠杆菌SoluBL21中异源表达并以Ni-NTA亲和纯化。底物筛选采用LC/ESI-MS/MS检测产物。NbCYP98在酿酒酵母中与C. scutellarioides细胞色素P450还原酶（CbCPR）共表达，制备微粒体后进行活性测定。系统发育分析使用MAFFT比对和IQ-Tree构建最大似然树。

研究结果如下。鉴定Neoblechnum brasiliense转录组中的BAHD酰基转移酶序列：通过长读长转录组测序，共获得47条BAHD序列，均含有HXXXDG和DFGWG保守基序，包括先前已鉴定的NbHCT1-9。BAHD酰基转移酶的生化表征：对38个新酶以70种酰基受体和7种酰基供体进行筛选，8个酶（NbHCT10, 11, 12, 13, 19, 20, 21, 22）显示可检测的产物形成。NbHCT10的生化表征：NbHCT10接受莽草酸、奎宁酸和2,5-二羟基苯甲酸，优先形成5-O-酯，以莽草酸为最佳底物。NbHCT11、12和13的生化表征：三者偏好奎宁酸，也接受莽草酸；其中NbHCT13对次要底物莽草酸的利用效率与NbHCT10相当。NbHCT19和20的生化表征：两者仅以ω-羟基棕榈酸为酰基受体，且仅接受含4-羟基的肉桂酰辅酶A供体；NbHCT19偏好阿魏酰辅酶A，NbHCT20偏好咖啡酰辅酶A。NbHCT21的生化表征：接受(R)-苯乳酸、(R)-4-羟基苯乳酸和(R)-3,4-二羟基苯乳酸，具有立体选择性；对p-香豆酰辅酶A和咖啡酰辅酶A的K_m分别为9.17和4.43 μM，对(R)-4-羟基苯乳酸的K_m为3.15 mM。该酶是N. brasiliense中唯一能形成RA前体的候选RAS。NbHCT22的生化表征：仅以l-色氨酸为受体，l-型比d-型效率高44倍，咖啡酰辅酶A是最佳供体，这是首次报道以l-色氨酸为底物的BAHD酶。BAHD酰基转移酶的系统发育和直系同源分析：NbHCT21和NbHCT22属于clade VI中的蕨类特异性亚枝VI-3；NbHCT10-13与NbHCT3构成clade V中局限于Polypodiales和Cyatheales的亚枝V-3；NbHCT19/20属于clade VI-1。NbCYP98A268的鉴定与生化表征：一个CYP98拷贝与CbCPR共表达，可羟化p-香豆酰色胺、p-香豆酰-N-酪胺、p-香豆酰-N-邻氨基苯甲酸和p-香豆酰-N-3-羟基邻氨基苯甲酸，但羟化发生在胺部分而非香豆酰部分。Neoblechnum brasiliense中苯丙烷途径的重建：从转录组中鉴定到酪氨酸氨基转移酶（TAT）、羟基苯丙酮酸还原酶（HPPR）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）和咖啡酰莽草酸酯酶（CSE）的同源基因，各序列具有保守催化基序，提示早期苯丙烷途径在蕨类中保守。

讨论部分指出，NbHCT21的系统发育位置表明RA合成酶在植物中至少存在三个独立进化起源；蕨类中的奎宁酸/莽草酸羟基肉桂酰转移酶可能经历基因重复和功能分化；NbCYP98对酰胺底物的偏好与早期陆生植物相似，暗示p-香豆酰-N-血清素可能作为防御化合物。研究还推测NbCYP98可能参与p-香豆酰色胺的羟化生成p-香豆酰-N-血清素。研究结论翻译如下：总之，研究人员生成了N. brasiliense的转录组，包含260万个高质量一致性亚型。转录组分析鉴定出47条不同的BAHD酰基转移酶序列，其中13个酶的底物已被确定。NbHCT21尤其值得关注：它属于一个蕨类植物谱系特异性进化枝，并催化迷迭香酸前体的形成，这使得它成为首个具有该催化活性的非种子植物BAHD酶。然而，仍需更多研究来理解NbHCT21在体内迷迭香酸和blechnic acid形成中的作用。八个HCT被证明利用莽草酸和奎宁酸作为底物；形成奎宁酸酯的酶与一个包含Polypodiales和Cyatheales目的谱系特异性进化枝相关。其他已确定的推定主要酰基受体包括色胺、ω-羟基棕榈酸和l-色氨酸，其中后者是BAHD酶的一个新底物。对于其余34个BAHD，尚未确定其酰基受体。从N. brasiliense转录组重建的苯丙烷途径显示，早期生物合成步骤是保守的，因为在早期分化的胚胎植物中已鉴定到功能同源物。相反，导致迷迭香酸和绿原酸生成的羟化步骤尚不清楚，需要进一步研究。推测NbCYP98A268通过羟化色胺衍生物参与形成p-香豆酰-N-血清素。