羟氯喹通过双重调控自噬流与NF-κB驱动炎症信号抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制

《Veterinary Research》：Hydroxychloroquine suppresses replication of PRRSV via dual regulation of autophagic flux and NF-κB-driven inflammatory signaling

　　

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）诱导过度自噬及活化的B细胞核因子κ轻链增强子（NF-κB）异常过度激活，引发猪严重呼吸与生殖障碍，并给全球养猪业造成巨大经济损失。羟氯喹硫酸盐（HCQ）作为经典自噬抑制剂，可在体外限制PRRSV增殖；然而其体内保护功效及双靶点分子机制仍表征不足。本研究中，肌内注射HCQ对仔猪致死性PRRSV感染提供强保护：完全消除病毒诱导的死亡，缓解发热和间质性肺部病变，并恢复正常生长性能。体外试验证实，在1–100 μM浓度范围内细胞毒性可忽略的HCQ干扰PRRSV感染的多个阶段。网络药理学与细胞功能实验结合揭示HCQ抗PRRSV的双重调控机制：HCQ阻断自噬体–溶酶体融合以破坏完整自噬流，并抑制IκBα-p65信号级联以减少促炎介质分泌。剂量–反应分析表明，HCQ在宽安全治疗窗内对不同田间PRRSV分离株、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）具有强效抗病毒活性，所有针对多种猪RNA病毒的广谱体外抗病毒活性均在细胞培养模型中得到验证。总之，HCQ通过同时调控自噬流和NF-κB依赖性炎症信号抑制PRRSV复制，支持其重定位为猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）控制的有前景治疗候选物。尽管HCQ在细胞培养中对不同PRRSV株、PEDV和SADS-CoV显示广谱抑制活性，但所有抗PEDV和抗SADS-CoV作用仅在体外验证，尚无体内动物验证。

研究背景方面，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV；引起猪繁殖与呼吸综合征的单股正链RNA动脉炎病毒）可诱导过度自噬及NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells；核因子κ轻链增强活化B细胞）异常过度激活，导致猪严重呼吸和生殖障碍，并造成全球养猪业巨大经济损失。PRRSV分为欧洲PRRSV-1和北美PRRSV-2基因型，基因组约15.4 kb。现有商业疫苗对持续变异的田间PRRSV株交叉保护有限，而针对猪RNA病毒的有效广谱小分子抗病毒药仍匮乏。HCQ（hydroxychloroquine sulfate；羟氯喹硫酸盐）为低毒性氯喹衍生物和经典自噬抑制剂，体外可限制PRRSV增殖，但其体内保护功效及双靶点分子机制仍不清楚。多种重要猪RNA病毒劫持宿主自噬机制促进复制并驱动病理性炎症，因此靶向自噬–炎症轴可能成为广谱抗病毒策略。研究人员据此系统评估HCQ体内外抗PRRSV效力，解析其对自噬和NF-κB介导炎症信号的抑制调控，并评价其对其他猪RNA病毒的广谱抗病毒活性。研究结论表明，HCQ通过同时调控自噬流和NF-κB依赖性炎症信号抑制PRRSV复制，支持其重定位为PRRS控制的有前景治疗候选物。

关键技术方法概括：研究使用猪肺泡巨噬细胞（PAMs；来自28日龄健康仔猪支气管灌洗）、Marc-145细胞和Vero细胞；病毒包括PRRSV XH-GD、GM30、NADC30，PEDV FS202201及SADS-CoV GDS04_P12（由Prof. Yongchang Cao提供，保存于Prof. Guihong Zhang实验室）。动物队列为18头28日龄Duroc × Landrace × Yorkshire仔猪，随机分空白、PRRSV、HCQ+PRRSV三组（n=6），气管内接种XH-GD 2×10⁵ TCID₅₀，HCQ按6.5 mg/kg每日肌注14天。方法包括CCK-8、Western blot、RT-qPCR、间接免疫荧光/共聚焦、ELISA、TCID₅₀滴度、网络药理学（靶点数据库、STRING/Cytoscape、GO/KEGG富集）、mCherry-EGFP-LC3自噬流报告及ROS检测。

研究结果如下。HCQ inhibited PRRSV replication in vitro：CCK-8显示HCQ在≤100 μM时细胞毒性可忽略；Western blot、RT-qPCR和间接免疫荧光显示HCQ剂量依赖降低PRRSV N蛋白、病毒RNA及感染强度，结论为HCQ在受试非细胞毒性浓度范围内抑制PRRSV体外复制。HCQ significantly increased the survival rate of PRRSV-infected piglets：18头仔猪三组试验中，14 dpi PRRSV组死亡率为33.3%（2/6），HCQ+PRRSV组为0；HCQ组体重逐步增加并接近对照组生长趋势，体温与对照组无显著差异，而PRRSV组体温升高；ELISA和RT-qPCR显示HCQ抑制仔猪病毒复制，结论为HCQ改善PRRSV诱导的体重下降和发热等临床症状。HCQ inhibited pathological changes in lungs of piglets infected with PRRSV：大体病理显示PRRSV组弥漫性肺肿大、充血、硬化、胸膜增厚和肺粘连，HCQ组仅轻度灰白胸膜病变；H&E显示PRRSV组严重间质性肺炎、肺泡隔增厚和大量炎细胞浸润，HCQ组仅轻度炎细胞浸润；病理评分显著降低。原文同时指出肺组织病毒RNA未定量，肺病理减轻可部分由血清病毒血症降低解释，尚缺乏局部肺病毒载量与病理缓解的直接证据。Effects of HCQ on interferon and inflammation levels in PRRSV-infected pigs：ELISA显示PRRSV组血清IFN-β、IFN-γ降低，HCQ部分恢复；PRRSV升高IL-6和IL-10，HCQ抑制IL-6过度分泌并部分逆转IL-10升高；RT-qPCR显示PRRSV使IL-6 mRNA升至近6倍、IL-10约2倍，HCQ下调二者至接近空白组；原文认为HCQ主要保护作用可能与抑制过度炎症信号、缓解炎症损伤和免疫失衡相关。Effects of HCQ on different stages of PRRSV infection：通过G1–G7时间控制方案，Western blot显示各干预窗口均降低PRRSV N蛋白；G4吸附阶段HCQ降低nsp9 mRNA和N阳性信号；G5早期附着后窗口降低病毒基因组；G6进入后早期胞内阶段降低N蛋白积累。结论为HCQ在PRRSV感染中发挥多阶段抗病毒作用，影响吸附相关事件及后续胞内复制相关过程，而非单一步骤；原文指出时间加入设计不能完全区分病毒内化与进入后事件，不能牢固确认HCQ直接阻断内化。Network pharmacology analysis identifies potential targets and pathways associated with hydroxychloroquine against PRRSV：收集42个HCQ相关靶点和17374个PRRSV相关宿主靶点，得到40个重叠候选靶点；PPI网络筛选IL-6和APP（acute phase proteins；急性期蛋白）为高连接枢纽；GO富集涉及循环调节、细胞信号、蛋白调控、膜/囊泡结构及受体相关调控活性；KEGG富集包括神经活性配体–受体相互作用、胆碱能突触和钙信号等；结论为网络药理学提供候选靶点和通路理论框架，APP功能仍需实验验证。HCQ suppresses PRRSV-triggered NF-κB inflammatory signaling：Western blot显示PRRSV诱导IκBα磷酸化和降解，HCQ剂量依赖降低p-IκBα/IκBα比值并减少N蛋白；共聚焦显示PRRSV诱导NF-κB p65核转位，HCQ使p65滞留胞质并减少核内积累；RT-qPCR显示PRRSV上调IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18，HCQ浓度依赖下调；结论为HCQ抑制PRRSV触发的NF-κB早期激活。HCQ disrupts PRRSV-induced autophagic flux：mCherry-EGFP-LC3报告显示PRRSV增加EGFP阳性和mCherry阳性LC3报告 puncta，HCQ进一步增加报告阳性puncta；Western blot显示HCQ诱导LC3-II积累并恢复SQSTM1/p62水平；DCFH-DA显示HCQ降低胞内ROS积累；结论为HCQ改变PRRSV触发的自噬反应，符合阻断自噬降解，并伴随ROS降低。Broad-spectrum in vitro antiviral activity of HCQ against diverse PRRSV strains, PEDV, and SADS-CoV：RT-qPCR、Western blot和TCID₅₀显示HCQ剂量依赖抑制GM30、NADC30等遗传差异PRRSV田间分离株的ORF7转录、N蛋白和感染性滴度；在Vero细胞中，HCQ同样剂量依赖降低PEDV和SADS-CoV的病毒RNA、结构蛋白和滴度；Vero细胞中≤100 μM无明显细胞毒性；IC₅₀分别为PRRSV GM30 7.17 μM、PRRSV NADC30 3.38 μM、PEDV 5.09 μM、SADS-CoV 3.51 μM，CC₅₀均>100 μM，选择性指数（SI）均>14，NADC30最高；结论为HCQ对多种猪RNA病毒具有广谱体外抗病毒活性及较好选择性。原文强调抗PEDV和抗SADS-CoV作用仅体外验证，尚无体内动物验证。

讨论部分总结：研究显示HCQ在体外和体内均保护对抗PRRSV感染；在培养细胞中，HCQ作用于病毒吸附和进入后复制阶段，并抑制PRRSV诱导的自噬流和NF-κB信号。由于常规时间加入实验不能完全分离病毒内化与进入后胞内事件，当前数据不能牢固确认HCQ直接阻断病毒内化，后续需专门独立试验明确其对PRRSV内吞摄取的影响。仔猪攻毒模型中，HCQ降低血清系统性病毒血症，缓解肺组织病理损伤和整体疾病严重度；HCQ还对遗传差异PRRSV株、PEDV和SADS-CoV显示广谱体外抗病毒活性，但抗PEDV和SADS-CoV efficacy仍需动物攻毒模型验证。作者讨论HCQ与氯喹的侧链差异及更优耐受性，认为其作为PRRSV控制重定位候选物具有潜力。机制上，HCQ作为溶酶体趋向性药物在溶酶体蓄积并中和酸性环境，损害溶酶体降解和自噬体–溶酶体融合；研究观察到HCQ抑制PRRSV诱导的自噬流并限制病毒复制。网络药理学预测APP和IL-6为连接HCQ相关靶点与溶酶体自噬流及NF-κB驱动炎症的互补调控节点，但APP相关功能 crosstalk 未做细胞或生化验证，仍属计算假设；IL-6为NF-κB依赖性促炎介质，HCQ抑制IκBα磷酸化降解、p65核转位和IL-6表达，但IL-6是否为HCQ保护作用的直接下游效应仍需实验验证。讨论还指出研究局限：体内效力仅在4周龄实验感染保育仔猪中评价，不同年龄、生理状态、妊娠母猪、育肥猪和自然感染商业猪群尚待确定；未鉴定HCQ在自噬相关或信号蛋白中的直接分子靶标，无生化互作数据；网络药理学预测未在分子水平实验验证；未全面解析自噬体–溶酶体融合和溶酶体功能的单独分子事件，未进行关键自噬相关基因的遗传功能缺失或救援实验；PEDV和SADS-CoV广谱作用未在相应动物攻毒模型评价；未系统开展药代动力学和药效学评价，最佳治疗剂量、给药频率、疗程、组织暴露和长期安全性尚未建立；自噬、NF-κB、氧化应激和炎症反应之间的完整调控网络仍未完全阐明。未来研究需通过遗传和生化试验鉴定HCQ直接分子靶标及自噬、NF-κB、氧化应激与PRRSV复制的因果关系，重点验证网络药理学预测如APP作用；需动物攻毒模型验证HCQ抗PEDV和SADS-CoV体内效力；可探索HCQ作为商业PRRS疫苗佐剂及田间应用对病毒排毒、疾病负担、安全性和生长性能的影响。

研究结论（原文翻译）：总之，HCQ通过同时调控自噬流和NF-κB依赖性炎症信号抑制PRRSV复制，支持其重定位为PRRS控制的有前景治疗候选物。原文同时指出，尽管HCQ在细胞培养中对不同PRRSV株、PEDV和SADS-CoV显示广谱抑制活性，但所有抗PEDV和抗SADS-CoV作用仅在体外验证，尚无体内动物验证。