内皮细胞p16表达鉴定透明细胞肾细胞癌预后良好亚群

《BMC Cancer》：Endothelial p16 expression identifies a subgroup of clear cell renal cell carcinoma with favorable prognosis

　　

背景：透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）以广泛血管生成和显著的组织结构异质性为特征。尽管血管密度已被作为ccRCC的预后参数进行研究，但关于瘤内内皮细胞的生物学特性知之甚少。 方法：本研究分析了包含347例具有临床病理和生存数据的ccRCC病例的组织微阵列（tissue microarray，TMA）队列中的p16表达，并将血管p16表达与先前描述的肿瘤组织结构亚型相关联。 结果：315例病例可评估肿瘤组织结构，并被分类为九种主要生长模式。具有厚小梁/岛状或实性片状组织结构的肿瘤被归类为高风险模式，并与更高的肿瘤分级和更短的总生存期相关（p<0.001）。肿瘤细胞p16表达罕见，且与临床病理参数或生存期无关联。相反，内皮细胞p16表达在瘤内血管中常见，每例阳性血管中位数为35%。较高程度和强度的内皮细胞p16表达均与较低肿瘤分级、较低pT分期、有利的组织结构模式和延长总生存期显著相关。此外，组织结构生长模式的预后影响在低内皮细胞p16表达的肿瘤中最为显著，而高内皮细胞p16表达的肿瘤无论组织结构亚型如何均显示可比较的生存期。 结论：内皮细胞p16表达在ccRCC中常见，并与有利的临床病理特征和延长生存期相关。这些发现提示内皮细胞p16表达可能补充ccRCC的组织结构肿瘤分层，识别预后良好的病例。

论文解读：内皮细胞p16表达与透明细胞肾细胞癌预后及组织结构模式的相关性研究

一、研究背景与目的

透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）约占所有肾细胞癌的80%，是肾脏最常见的恶性肿瘤。ccRCC的生物学标志性特征是其显著的血管生成能力，这主要由von Hippel-Lindau（VHL）肿瘤抑制基因失活及随后的缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）依赖性信号通路激活所驱动，尤其是VEGF轴。尽管现代抗血管生成治疗策略基于这一高度血管化的表型，但ccRCC仍与显著的发病率和死亡率相关。

除传统的临床病理参数如分期、分级和坏死外，ccRCC表现出显著的组织形态学和生物学异质性。既往研究已证明ccRCC可细分为具有不同预后和分子特征的组织结构生长模式，其中致密实性和厚小梁生长模式与更具侵袭性的肿瘤行为相关，而巢状和微囊性结构往往与更有利的预后相关。然而，尽管ccRCC中的血管生成已被广泛研究，但对瘤内内皮细胞的生物学特征和功能状态了解甚少。肿瘤相关内皮细胞日益被认为是肿瘤微环境的活跃组分而非被动结构元件，其异质性可能代表ccRCC进展中的额外生物学复杂性层。

在此背景下，细胞衰老已成为肿瘤细胞和肿瘤微环境中的重要生物学程序。p16^INK4a-Rb通路是衰老的主要调控因子之一，p16表达已被广泛用作不同生理和病理环境中的衰老相关标志物。然而，内皮细胞p16表达及可能的血管衰老在ccRCC中的作用仍知之甚少。基于此，研究人员在大型ccRCC队列中分析了肿瘤细胞和瘤内内皮细胞的p16表达，并将其与组织结构生长模式、临床病理参数和患者生存期相关联，旨在探讨内皮细胞p16表达是否能识别具有潜在预后意义的生物学和临床独特的血管表型。

二、主要技术方法

本研究基于德国波恩大学医院2006至2015年间接受根治性或部分肾切除术的347例ccRCC患者的存档福尔马林固定石蜡包埋组织样本，构建组织微阵列（tissue microarray，TMA），每例选取两个形态学代表性的1mm直径肿瘤核心。采用免疫组织化学染色检测p16表达（Ventana ultraView DAB检测系统，克隆E6H4），并通过CD31免疫组织化学染色（克隆JC70A）验证所评估结构的血管性质。在苏木精-伊红（H&E）染色切片上根据Cai等人描述的分类评估肿瘤组织结构生长模式，显微镜下评估内皮细胞p16染色的百分比和强度。统计分析采用SPSS 29版本，包括Mann–Whitney U检验、Pearson相关分析、Kaplan–Meier生存分析和log-rank检验，以及单变量和多变量Cox比例风险回归分析。

三、研究结果

1. 生长模式与肿瘤生物学和生存期相关

根据Cai等人的分类，315例病例可评估组织结构生长模式。最常见的是小巢模式（31.7%），其次是厚小梁/岛状模式（19.4%）和实性片状模式（16.2%）。生存分析显示，厚小梁/岛状和实性片状组织结构的肿瘤临床结局较差，这两类被归类为高风险模式（high-risk patterns，HRP），其余模式归类为低风险模式（low-risk patterns，LRP）。HRP肿瘤患者的总生存期显著短于LRP肿瘤患者（log-rank检验，p<0.001）。高风险生长模式与高肿瘤分级（G3/G4）和远处转移的存在显著相关。

2. 内皮细胞p16表达在ccRCC血管系统中常见

肿瘤细胞p16表达罕见，347例中仅60例（17.3%）显示局灶性p16阳性肿瘤细胞簇，且与任何临床病理参数均无关联。相反，内皮细胞p16表达在瘤内血管中频繁观察到，325例中285例（87.7%）存在p16阳性血管，每例阳性血管比例从0%到100%不等，中位数为35%。CD31阳性血管与p16染色的并排比较证实了内皮细胞的p16阳性。

3. 血管p16表达与有利的临床病理参数和延长生存期相关

较高程度和强度的内皮细胞p16表达均与低分级肿瘤（G1/G2）显著相关，器官局限性肿瘤（pT1/pT2）比局部晚期肿瘤（pT3/pT4）显示显著更高的内皮细胞p16表达和染色强度。淋巴结转移和远处转移的肿瘤显示显著较低的内皮细胞p16阳性和染色强度。Kaplan–Meier生存分析显示，高内皮细胞p16表达（定义为强染色强度或p16阳性血管比例高于队列中位数35%）与显著延长的总生存期相关。值得注意的是，低内皮细胞p16染色强度的病例显示与p16阴性病例相当的生存期。

4. 血管p16表达与生长模式和肿瘤分级相关

小巢结构肿瘤显示高内皮细胞p16表达，而实性片状和厚小梁/岛状生长模式显示较低的内皮细胞p16阳性。Pearson相关分析显示，较高的pT分期与内皮细胞p16染色强度和阳性血管比例呈负相关，内皮细胞p16染色强度和阳性血管比例均与较低肿瘤分级和更有利的组织结构生长模式显著相关。

5. 内皮细胞p16表达分层下组织结构生长模式的预后影响

在无或低内皮细胞p16表达的肿瘤中，高风险生长模式与显著较短的总生存期相关（log-rank检验，p=0.009）。相反，在高内皮细胞p16染色强度的肿瘤中，高风险和低风险生长模式之间无显著生存差异。按p16阳性血管比例分层时，低内皮细胞p16阳性肿瘤中低风险生长模式显示显著更好的总生存期（p=0.002），而在≥35% p16阳性内皮细胞的肿瘤中，高风险和低风险生长模式之间的生存差异不再显著（p=0.194）。

6. 总生存期的Cox回归分析

单变量Cox回归分析中，高风险组织结构生长模式与显著较短的总生存期相关（HR：2.496，95% CI：1.597–3.899，p<0.001），高比例p16阳性血管与死亡风险降低相关（HR：0.462，95% CI：0.296–0.722，p<0.001）。多变量Cox回归模型（199例，76个事件）中，pT分期（HR：2.338，95% CI：1.425–3.835，p<0.001）、远处转移（HR：2.919，95% CI：1.517–5.616，p=0.001）和高风险组织结构生长模式（HR：2.070，95% CI：1.203–3.561，p=0.009）仍独立与较短总生存期相关，而肿瘤分级、淋巴结状态和p16阳性血管比例未保留独立预后意义。

四、讨论与结论

本研究表明内皮细胞p16表达是ccRCC中的常见发现，并与较低侵袭性的临床病理特征、有利的组织结构生长模式和延长总生存期相关。在多变量Cox回归模型中，内皮细胞p16表达与组织结构生长模式和既定临床病理参数密切相关，但未提供超出这些变量的独立预后信息。因此，内皮细胞p16表达似乎反映了与ccRCC临床结局相关的有利血管和形态学肿瘤结构。

值得注意的是，分层生存分析显示组织结构生长模式的预后影响因内皮细胞p16表达而异：高风险生长模式仅在低内皮细胞p16阳性的肿瘤中与显著较短的总生存期相关，而高内皮细胞p16表达的肿瘤中组织结构亚型间无显著生存差异。这支持ccRCC中血管表型与肿瘤结构之间的密切关系。

研究人员指出，p16免疫反应性本身不足以确定功能性衰老，需要进一步使用额外衰老相关标志物的研究来阐明该p16相关表型的生物学性质。内皮细胞p16表达在ccRCC中可能代表一种前衰老内皮表型，缺乏终末期衰老典型的显著促炎分泌谱，这可能与ccRCC中较低水平的瘤内免疫细胞浸润与有利预后相关的观察一致。

结论：研究人员证明p16表达在ccRCC内皮细胞中比在肿瘤细胞本身中更常见。血管p16表达与低风险生长模式及更长的总生存期相关。这些发现提示肿瘤相关内皮细胞中的p16表达反映了更有利的血管和组织结构肿瘤生长及临床结局。该研究受限于其回顾性单中心设计和缺乏独立外部验证队列，需要进一步研究阐明内皮细胞p16表达的功能意义及其与ccRCC血管衰老的关系。