自然杀伤（NK）细胞TGF-β信号调控出生后肺发育：衰老内皮细胞清除平衡与支气管肺发育不良（BPD）治疗靶点

《Circulation Research》：Natural Killer Cell TGF-β Signaling Regulates Postnatal Lung Development

　　

背景：支气管肺发育不良（BPD）是一种新生儿肺发育疾病，与肺血管化受损、转化生长因子-β（TGF-β）信号失调及衰老细胞积累相关。尽管TGF-β信号在促进血管重塑和抑制自然杀伤（NK）细胞衰老细胞溶解活性中的作用已明确，但NK细胞TGF-β信号对出生后肺模式形成及BPD发病机制的贡献仍不清楚。方法：研究人员分析了携带NK细胞选择性II型TGF-β受体（Tgfbr2）缺失的小鼠（Tgfbr2^NK?/?）在新生期和成年期时间点的血管与肺泡结构、肺NK细胞浸润、衰老标志物及肺功能检测。采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）评估新生小鼠和BPD婴儿的肺组织。在Tgfbr2^NK?/?新生小鼠中以及通过TGF-β配体陷阱/白细胞介素-15（IL-15）超激动剂HCW9218的药理学方式，检测增强NK细胞活性对高氧诱导BPD模型的影响。结果：新生Tgfbr2^NK?/?小鼠表现出远端小动脉密度基线降低、肺泡化受损以及长期肺功能的性别特异性缺陷。单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现，Tgfbr2^NK?/?新生小鼠肺内对TGF-β不敏感的NK细胞过度清除衰老内皮细胞。这种增强的NK细胞活性在未处理Tgfbr2^NK?/?小鼠中促成BPD样表型，但在高氧条件下保护这些动物免受肺发育受损。对BPD婴儿肺组织的测序证实NK细胞存在过度TGF-β信号和细胞毒性功能受损。HCW9218治疗可防止高氧小鼠模型中的衰老细胞积累并挽救肺发育。结论：TGF-β是NK细胞衰老细胞溶解活性的可调调节因子，对正常出生后肺发育必不可少。过度的NK细胞TGF-β信号参与新生期高氧相关肺发育受损，并可能成为人BPD的可行治疗靶点。

肺内血管与气道发育高度整合。支气管肺发育不良（BPD）是极早产儿常见并发症和婴儿呼吸病残及死亡的重要原因，以远端肺循环稀疏和肺泡模式简化为特征。既往研究提示BPD与肺血管化受损、TGF-β信号失调及衰老细胞积累相关；TGF-β可促进血管重塑并抑制NK细胞衰老细胞溶解活性，但NK细胞TGF-β信号对出生后肺模式形成及BPD发病的作用尚不清楚。为此，研究人员构建NK细胞选择性Tgfbr2缺失（Tgfbr2^NK?/?）小鼠，在新生期和成年期评估血管与肺泡结构、NK细胞浸润、衰老标志物和肺功能，并结合人BPD肺组织scRNA-seq及高氧BPD模型和HCW9218干预。研究结论为TGF-β是NK细胞衰老细胞溶解活性的可调调节因子，对正常出生后肺发育必不可少；过度NK细胞TGF-β信号参与新生期高氧相关肺发育受损，并可能成为人BPD的可行治疗靶点。该研究将免疫介导的细胞衰老控制与肺血管发育、组织模式形成联系起来，论文发表在《Circulation Research》。

方法上，研究人员采用Ncr1-iCre介导的NK细胞选择性Tgfbr2缺失小鼠（Tgfbr2^NK?/?）及Ai6 ZsGreen报告，在新生至成年多个时间点分析肺血管、肺泡、NK细胞、衰老标志物和肺功能；开展离体TGF-β刺激与流式检测、NK细胞分离和衰老内皮细胞共培养细胞毒性实验、钡灌注微型CT、免疫荧光、肺形态计量、右心导管及离体肺功能测试；建立新生小鼠95% O₂高氧BPD模型并给予HCW9218（10 mg/kg S.Q.）；对P3小鼠肺组织行scRNA-seq（n=8/基因型，4雌4雄）；人BPD（50–52周校正胎龄）与足月对照（约40–41周）肺组织scRNA-seq数据来自Vanderbilt University Medical Center的Sucre Lab。

研究结果：（1）Tgfbr2^NK?/?小鼠表现出肺循环发育不良和轻度肺动脉高压。通过钡灌注微型CT（microCT）、血管性血友病因子（vWF）/平滑肌α-肌动蛋白（αSMA）免疫荧光、右心导管和右心室肥厚指数（Fulton index）评估，发现远端小动脉（约100 μm）丢失、肺小动脉密度降低、右心室收缩压轻度升高而无明显右心室肥厚；同时验证NK细胞对TGF-β不敏感。（2）NK细胞TGF-β信号缺失损害出生后肺泡发育，导致长期肺功能性别依赖性降低。通过P1–P14平均线性截距（LM）和成年肺泡管面积、离体肺压力-容积测试，发现P5–P7肺泡隔化受损而P14恢复；成年雄性Tgfbr2^NK?/?小鼠平均肺泡管面积增加、充气顺应性降低，提示性别依赖的长期肺功能缺陷。（3）Tgfbr2^NK?/?小鼠肺血管发育受损与NK细胞进入新生肺同步。通过P1–P14小动脉密度和内皮黏蛋白（Emcn）染色及ZsGreen⁺ NK细胞计数，发现P3小动脉密度呈下降趋势、P5显著降低，毛细血管覆盖无差异；NK细胞出生时少，P3达峰值且Tgfbr2^NK?/?小鼠升高至P7，P14近零；血管表型先于肺泡表型。（4）scRNA-seq发现Tgfbr2^NK?/?新生肺内皮衰老减少和NK细胞细胞毒性增强。通过P3肺scRNA-seq，发现一般毛细血管细胞（gCaps）中β-半乳糖苷酶1（Glb1）下调、发育相关衰老基因集下调，血管生成/ERK-MAPK/VEGF基因集富集；NK细胞丰度和NK介导细胞毒性通路上调；NK-内皮通讯中TRAIL和NKG2D信号上调、ephrin-B信号缺失，3型固有淋巴细胞（ILC3）无差异。（5）NK细胞TGF-β不敏感增强发育肺中衰老内皮细胞清除。通过P3衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、Emcn/β-Gal免疫荧光及离体NK细胞与衰老内皮细胞共培养，发现Tgfbr2^NK?/?小鼠肺SA-β-Gal⁺细胞减少，Tgfbr2^NK?/? NK细胞基线衰老细胞清除增强，且TGF-β不能抑制其衰老细胞溶解功能。（6）人BPD中NK细胞TGF-β信号升高。通过人BPD（50–52周校正胎龄）与足月对照（约40–41周）肺scRNA-seq，发现BPD中NK细胞比例降低，效应功能基因集负富集、细胞对TGF-β反应正富集；关键细胞毒基因包括5个颗粒酶中4个下调；NK-内皮通讯显示内皮到NK的TGF-β信号上调、NK到内皮GZMA配体-受体下调。（7）抑制NK细胞TGF-β信号减轻高氧诱导BPD。通过新生Tgfbr2^NK+/+和Tgfbr2^NK?/?小鼠95% O₂暴露72 h及HCW9218（10 mg/kg S.Q.）药理干预，发现Tgfbr2^NK?/?小鼠部分免受高氧所致肺泡和血管发育受损；HCW9218扩张NK细胞、增强颗粒酶B（GzmB）表达、减少SA-β-Gal⁺细胞、恢复P3小动脉密度、防止P7肺泡化受损。

讨论部分指出，NK细胞亚群可影响妊娠等生理性重塑及肿瘤中的血管结构，但其在肺循环发育和维持中的作用此前未明。本研究通过实验性靶向NK细胞TGF-β信号，发现该免疫细胞群是晚期囊泡期肺发育的关键调节者。一定程度的生理性TGF-β信号对抑制NK细胞过度活性、指导正常肺模式形成是必要的，但在高氧BPD模型中，遗传或药理靶向NK细胞TGF-β轴可恢复肺泡化和血管发育。人BPD肺组织scRNA-seq提供NK细胞功能障碍的首个报道证据。研究局限包括人BPD与足月对照的校正胎龄差异、人NK细胞缺乏功能验证，以及HCW9218研究缺少对照化合物以区分TGF-β隔离与IL-15激动作用；未来需长期高氧模型和成年期心肺功能评估。研究结论翻译如下：TGF-β是NK细胞衰老细胞溶解活性的可调调节因子，对正常出生后肺发育必不可少；过度的NK细胞TGF-β信号参与新生期高氧相关肺发育受损，并可能成为人BPD的可行治疗靶点。