左氧氟沙星（LVX）负载Pistacia lentiscus油纳米乳的壳聚糖基生物黏附半固体平台构建及其理化特性、抗氧化与抗金黄色葡萄球菌活性研究

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Development and characterization of a nanoemulsion-based semisolid platform: Physicochemical properties, antioxidant and antimicrobial activities

　　

• 针对持续性金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染的创新型生物黏附平台。
• 负载左氧氟沙星（LVX）的乳香黄连木（Pistacia lentiscus）油纳米乳用于局部皮肤递送。
• 壳聚糖基黏附基质增强纳米乳性能。
• 生物活性纳米乳表现出适宜的生物相容性和抗氧化活性。
• 生物黏附系统增强感染皮肤模型中的抗菌活性。

**研究背景与意义**：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为革兰阳性兼性共生/机会致病菌，可引起皮肤软组织感染至肺炎、心内膜炎、骨髓炎、脓毒症等；其毒力因子及生物膜形成促进慢性、复发性皮肤感染，并加重耐药和常规治疗失败。耐甲氧西林S. aureus（MRSA）流行使新型治疗策略成为需求。左氧氟沙星（levofloxacin, LVX）为第三代氟喹诺酮，对葡萄球菌等革兰阳性皮肤病原具广谱杀菌活性，但全身给药不良反应和选择压力明显；局部LVX受皮肤穿透有限及对生物膜内菌活性不足限制。纳米乳（nanoemulsions, NEs）等纳米载体可提高溶解性、稳定性、皮肤穿透和局部释放；油相可提供抗菌、抗炎或屏障支持。Maurizi等前期证明乳香黄连木（Pistacia lentiscus）油（LO）基NEs及负载LVX的NEs（NEsL）具抗葡萄球菌及抗生物膜活性，但其作为皮肤感染局部递送系统尚未探索；常规局部制剂滞留短。故本研究将LO基NEsL整合入壳聚糖基先进配方（advanced formulation, AF），构建局部生物黏附递送平台，并评价其理化、生物相容性、抗氧化、渗透/滞留及抗S. aureus皮肤感染性能。

**关键技术方法**：采用鸡胚尿囊膜试验（hen's egg test–chorioallantoic membrane, HET-CAM）评价刺激性；HaCaT角质形成细胞MTT法评价细胞毒性；DPPH自由基清除、还原力、总抗氧化能力（total antioxidant capacity, TAC）及H₂O₂诱导HaCaT氧化应激评价抗氧化；动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）与ζ电位测粒径、多分散指数（polydispersity index, PDI）及表面电荷；制备AF并行厚度、倾斜玻璃板黏附、扫描电镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）；Franz扩散池以Strat-M合成膜及离体猪耳皮肤（本地意大利供应商）评价渗透/滞留；90天4/25 ℃稳定性；以S. aureus ATCC 6538P行最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）及离体猪耳皮肤感染模型。

**研究结果**：3.1 刺激性试验：HET-CAM显示NEs与NEsL无出血、溶解、凝血，S-score为0；NaOH阳性对照S-score为16，支持局部应用耐受性。3.2 角质形成细胞细胞毒性：MTT显示NEs/NEsL仅在较高浓度（2.5 μg/mL）出现细胞毒，NEsL与NEs略有差异；游离LO各浓度均细胞毒（数据未显示），提示包封可调节LO释放和细胞接触。3.3 抗氧化活性：3.3.1 DPPH自由基清除：25–125 μg/mL下，25 μg/mL清除最高，NEsL为66.4%、NEs为54%；高浓度存在非线性和光干扰，仅为初步定性。3.3.2 还原力：低浓度NEs高于NEsL，75 μg/mL相当，125 μg/mL NEsL较高，提示LVX可能贡献。3.3.3 TAC：仅25和50 μg/mL可靠；NEsL的抗坏血酸当量（ascorbic acid equivalents, AAE）为11.94/12.67 μg/mL，NEs为11.83/11.92 μg/mL，50 μg/mL时NEsL显著高于NEs。3.3.4 角质形成细胞抗氧化：0.5 mM H₂O₂降低HaCaT活力约50%；NEs在0.31 μg/mL、NEsL在0.63和0.31 μg/mL显著恢复，0.16 μg/mL无效，呈有限浓度窗细胞保护。3.4 DLS和ζ电位：非细胞毒浓度下NEs粒径160.55 nm、PDI 0.13、ζ电位?27.81 mV；NEsL为168.37 nm、0.17、?30.21 mV，保持原特征。3.5 AF及载药AF制备：壳聚糖基半固体制备成功；AF、AF-LVX、AF-NEs、AF-NEsL厚度相近且适合皮肤应用；空AF与AF-LVX透明，含NEs者因LO呈黄色。3.6 黏附研究：90°倾斜玻璃板上60 min内各配方均未滑脱；含NEs者更接近原位，其他轻微位移；该法仅提供定性黏附信息。3.7 SEM形态：AF表面均一紧凑并有长链和聚合物团聚；AF-LVX类似；AF-NEs呈密集三维絮凝结构；AF-NEsL短窄链交织分支并增加表面粗糙度。3.8 体外和离体渗透：3.8.1 Strat-M：各配方渗透约10%，游离LVX约30%；AF-LVX大多滞留供体；NEsL与AF-NEsL超过70%滞留膜内，提示强屏障相互作用和局部递送。3.8.2 猪耳：3.8.2.1皮肤厚度约0.8±0.1 mm，适合渗透研究；3.8.2.2 ex vivo中NEsL与AF-NEsL 5 h渗透≤15%，约70%滞留皮肤，与Strat-M结果一致，支持局部定位。3.9 AF稳定性：90天4/25 ℃下AF、AF-NEs、AF-NEsL无可见宏观改变和显著失重，壳聚糖基质维持结构稳定，NEs未明显破坏系统。3.10 离体感染模型：猪耳皮肤感染S. aureus ATCC 6538P后，亚抑菌浓度NEs/NEsL单用不能抑制细菌生长；AF-NEs与AF-NEsL显著降低菌落形成单位（colony-forming units, CFU）/mL，其中AF-NEsL降低最明显；现有数据不能确定壳聚糖、LO与LVX的协同或相加作用。

**讨论与结论**：讨论指出黏附评价仅在惰性基底定性进行，未测脱附力；抗菌仅用参考菌株，未纳入临床分离株或MRSA；尚需体内验证、更广临床菌株、规模化/灭菌、货架期及化学生物稳定性研究。结论翻译：纳米乳递送系统作为平台初步构建单元，在测试条件下无细胞毒性及皮肤刺激；以Pistacia lentiscus油为功能油相的生物活性NEs具可测抗氧化活性，提示内在功能贡献；含LVX-NEsL的壳聚糖基半固体成功开发并具局部递送潜力；半固体物理化学稳定；Strat-M及离体皮肤渗透显示最佳配方跨屏障扩散有限、药物滞留于膜/组织；感染皮肤模型显示AF-NEsL细菌活力降低最明显，支持进一步研究其局部抗细菌感染应用。