N-乙酰-L-精氨酸（NALA）与二糖联合提升siRNA脂质纳米粒冻干稳定性及生物活性保持

《International Journal of Pharmaceutics: X》：Enhanced stability of siRNA-loaded lipid nanoparticles during lyophilization via acetyl-arginine and disaccharides

　　

负载RNA的脂质纳米粒（lipid nanoparticles, LNPs）对温度波动高度敏感，这给其储存和运输带来显著挑战。冷冻干燥是提高储存稳定性的一种潜在策略；然而，冻干过程会使纳米粒承受多种应力，可能改变其理化性质并损害RNA完整性。本研究评估了制剂组成对负载小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的LNPs在冻干后稳定性和功能性的影响。在所测试的制剂中，10%（w/v）海藻糖与50 mM N-乙酰-L-精氨酸（N-acetyl-L-arginine, NALA）的组合在冻干后最有效地保持了粒径和包封效率。与相应的含精氨酸制剂相比，基于NALA的制剂在4 °C、25 °C和40 °C下也表现出更好的储存稳定性。冷冻透射电子显微镜（cryo-transmission electron microscopy, Cryo-TEM）分析显示，含NALA的LNPs在冻干后保持球形形态和均一内部核心，表明冻干过程中结构保护得到改善。此外，含NALA的复溶后siRNA-LNPs保持了与冻干前样品相当的细胞功能。这些结果表明，基于海藻糖和NALA的稳定剂体系可增强冻干siRNA-LNPs的稳定性，同时保持其理化性质和生物活性。

研究背景：RNA-LNPs技术推动RNA治疗发展，FDA已批准COVID-19 mRNA疫苗和siRNA药物Onpattro^?等。但RNA-LNPs储存稳定性有限、依赖冷链，机械和化学应力可致聚集、清除和细胞摄取下降；脂质氧化产生亲电物种形成共价脂质-RNA加合物，核心结构相关水约18–24%可促进水解和氧化。冻干通过除水减少降解，但冻结/干燥阶段存在冷冻浓缩、局部pH变化、离子强度升高、脂质相变、聚集和RNA泄漏等应力；缓冲液和离子改变静电相互作用与胶体稳定性。有效稳定需要保护剂替代水化壳并形成高T_g’无定形玻璃基质，以动力学固定分子运动。糖类如海藻糖主要靠水替代和玻璃化，但单独不足以完全防止静电驱动聚集或化学降解。siRNA-LNP如Onpattro^?仍需冷藏液体剂型，需改善固态稳定性。精氨酸用于蛋白和纳米粒冻干以减少聚集，但高离子强度可影响T_g’并加速化学降解；NALA为精氨酸化学修饰衍生物，前期显示可抑制蛋白聚集和亚可见颗粒。因此研究人员系统考察缓冲液、盐、二糖、精氨酸和NALA对siRNA-LNP冻干稳定性的影响，目标是确定维持干燥状态结构完整性和功能性能的稳定剂组合。

关键技术方法（≤250字）：采用动态光散射（DLS）测定Z-average粒径、多分散指数（PDI）和等电点（IEP）；RiboGreen法测包封效率（EE）；卡尔费休法测残余水分；粉末X射线衍射（PXRD）和差示扫描量热法（DSC）分析固态性质与T_g’；Cryo-TEM观察形态；开展冻融、冻干、60天储存及99 rpm机械应力实验；以CaSki细胞活力试验和RT-PCR评价HPV16 E6/E7与p21 mRNA表达。siRNA-LNP及标准siRNA来源于EnhancedBio Inc.（Seoul, Korea），siRNA-LNP采用246c10脂质和1 mol% C₁₆ PEG_2K-ceramide构建。

3.1 冻干保护剂在冻干中的作用：未加保护剂时冻干饼塌陷，粒径由164.1 nm升至435.4 nm，EE由87.3%降至20.3%；甘露醇、蔗糖和海藻糖均可减轻但不能完全阻止粒径增大和EE下降，甘露醇组变化最大且PXRD显示结晶相。综合粒径、PDI和EE，10%海藻糖较优，冻干后粒径278.1 nm、EE 75.5%；其保护与水替代和玻璃化有关。3.2 制剂介质对冻干中siRNA-LNP的影响：DLS滴定显示IEP为8.56，pH>7时ζ电位低于30 mV并伴随粒径显著增大。冻干后DEPC水组变化较小（161.1 nm，EE 84.1%），而组氨酸、PBS和Tris-EDTA组粒径增加更明显、EE下降更多；作者指出介质初始pH、组成和缓冲能力不同，不能将DEPC水条件直接视为药物储存或给药介质。3.3 NaCl浓度对冻干中siRNA-LNP的影响：冻融循环中含NaCl组粒径升高、EE下降；冻干后含NaCl组粒径增加约200–300 nm、EE较冻干前下降约30%。不含NaCl的10%海藻糖组变化较小，但冻干后粒径仍增加约30 nm、EE下降约10%，提示单用10%海藻糖不足以完全抑制冻干引起的理化变化。3.4 siRNA-LNP冻干制剂开发：与精氨酸组相比，含NALA组冻干后粒径和EE变化更小；50 mM NALA+10%海藻糖组粒径仅增加约5 nm、EE下降约4%。Cryo-TEM显示冻干前两组均为球形均一核心；冻干后精氨酸组明显融合、内部异质并出现类水相泡状结构（blebs），NALA组大多保持离散球形。冻干前两组聚集/融合结构<2%；冻干后精氨酸组多数可评价结构融合或边界消失，NALA组约7%。T_g’分别为10%海藻糖组?28.9 °C、加50 mM精氨酸组?30.0 °C、加50 mM NALA组?28.8 °C，提示差异不能主要归因于T_g’；PXRD未见精氨酸或NALA明显结晶差异。3.5 冻干siRNA-LNP的体外生物活性：CaSki细胞中，未冻干siRNA-LNP使细胞活力约36–41%；NALA组冻干后保持相当的反应，PBS或DEPC水组活力升高，精氨酸组>60%。E6/E7 mRNA表达中，PBS和DEPC组冻干前后无显著差异；精氨酸和NALA冻干组低于PBS/DEPC组，50 mM NALA组降低最强。p21 mRNA在NALA组与未冻干对照相当，精氨酸组显著降低；表明NALA组在理化性质、E6/E7沉默、p21维持和细胞活力间更一致。3.6 冻干siRNA-LNP的储存稳定性和机械应力测试：残余水分在10%海藻糖、加精氨酸和加NALA组分别为3.64±0.72%、3.59±0.10%和3.25±0.43%（w/w），组间相近。4 °C、25 °C、40 °C储存60天中，NALA组粒径变化最小；精氨酸组25 °C由约310 nm升至373 nm，40 °C达约1039 nm。海藻糖体系中NALA较PBS和精氨酸更好维持粒径与EE；蔗糖体系中NALA效果较弱。99 rpm、25 °C、3天机械应力后，海藻糖+NALA冻干组较未冻干和精氨酸组更好维持粒径与EE；蔗糖+NALA组可限制粒径变化但EE仍下降。3.7 未来展望：作者强调冻干稳定性高度依赖制剂组成和工艺，无通用策略；需在多样LNP组成中验证NALA-海藻糖组合，并研究表面电荷、分子运动、分子间相互作用和冻干微环境等机制，加入无siRNA或非靶向siRNA对照，开展更长储存、湿度、重复运输应力及体外/体内相关性研究。

讨论部分总结：作者认为NALA与海藻糖提供互补稳定机制：海藻糖通过水替代和形成无定形玻璃基质限制干燥/复溶中的分子运动；NALA通过胍基-磷酸相互作用结合磷脂表面，其N^α-乙酰化中和精氨酸中的一个阳离子位点，改变界面性质并在冷冻浓缩条件下维持较有利的排斥性界面，减少颗粒-颗粒缔合。T_g’和PXRD结果提示两组稳定性差异不能主要归因于玻璃化转变或可检测结晶；残余水分相近也提示储存差异非主要由残余水造成。作者同时指出研究限于特定siRNA-LNP平台和冻干条件，机制及长期稳定性仍需进一步研究。

研究结论（译文）：本研究考察了制剂因素如何影响负载siRNA的LNPs在冻干及后续储存中的稳定性。在所测试的糖类稳定剂中，基于粒径、PDI和包封效率的综合评价，选择10%海藻糖用于后续制剂研究。制剂介质组成影响冻干稳定性，NaCl的存在与粒径增加和包封效率下降相关，这些变化可能反映冷冻浓缩条件下的静电屏蔽和渗透应力。为提高冻干稳定性，研究人员将精氨酸和NALA与10%海藻糖联合作为附加稳定剂进行评价。NALA在冻干后保持粒径、包封效率和形态方面优于精氨酸。值得注意的是，含50 mM NALA和10%海藻糖的制剂在冻干、储存和机械应力过程中有效保持siRNA-LNPs的理化性质，同时维持冻干后的体外生物活性。这些结果表明，NALA-海藻糖组合是本研究所考察的siRNA-LNP体系的一种有前景的稳定化策略，并提示在冻干RNA-LNP制剂设计中应考虑界面稳定性和无定形基质形成。