长读长纳米孔测序在儿童中枢神经系统肿瘤分子诊断中的综合评估

《Acta Neuropathologica Communications》：Diagnostic evaluation of long-read nanopore sequencing for pediatric CNS tumors

长读长纳米孔测序能够在单次检测中实现基于甲基化的中枢神经系统（CNS）肿瘤分类，同时提供额外的基因组信息。然而，其在儿童CNS肿瘤诊断相关的多种分子特征以及现有甲基化分类器上的表现尚未被充分阐明。本研究评估了纳米孔测序用于儿童CNS肿瘤整合分子表征的效果，并与临床诊断流程中使用的DNA甲基化芯片和Illumina短读长测序数据进行了比较。研究人员对代表三个主要儿童CNS肿瘤组（胶质瘤、室管膜瘤和髓母细胞瘤）的20份肿瘤样本进行了长读长纳米孔测序，在所有肿瘤组中都获得了稳健的长读长数据，平均基因组覆盖度约为40x。源自纳米孔的拷贝数谱与甲基化芯片衍生的拷贝数谱显示出良好的一致性（中位Pearson r = 0.816）。在Illumina测序检测到的78个临床相关小变异中，研究人员识别出了74个（95%）的纳米孔证据，尽管其中53个（68%）被精确地恢复为高置信度的纳米孔检出。结构变异谱显示，Illumina和纳米孔测序之间断点重叠有限，且在检出事件的数量、类型和大小分布上存在差异。源自纳米孔的甲基化分类与整合的WHO CNS5诊断大体一致。室管膜瘤、髓母细胞瘤和毛细胞型星形细胞瘤在所有评估的分类器中均得到了一致性分类，尽管并非所有分类都达到了各自分类器特定的置信阈值。相比之下，弥漫性胶质瘤在不同分类器间的分类变异性更大。降采样分析表明，在测序深度大幅降低的情况下，与整合WHO CNS5诊断的一致性仍然很高，而达到分类器特定置信阈值的分类比例则更依赖于具体分类器。长读长纳米孔测序能够在单次检测中实现对儿童CNS肿瘤的整合分子表征，尽管与既定方法的一致性因基因组特征和肿瘤类型而异。在降低测序深度下仍能保持甲基化分类性能，这支持了缩短测序工作流程的可行性。未来需要前瞻性研究来确定其在常规临床诊断中的性能和周转时间。

研究背景与目的

儿童中枢神经系统（CNS）肿瘤是儿童中最常见的实体恶性肿瘤，也是导致癌症相关发病率和死亡率的主要原因。与成人CNS肿瘤不同，儿童CNS肿瘤起源于独特的发育和生物学过程，具有独特的分子驱动因素、表观遗传景观和临床表现。因此，准确的肿瘤诊断对于风险分层、治疗策略制定和长期预后至关重要。2021年世界卫生组织（WHO）第五版CNS肿瘤分类（WHO CNS5）强调了分子诊断的重要性，采用结合组织病理学与分子及表观遗传特征的整合诊断方法。DNA甲基化分析已成为一种稳健且信息量极大的儿童CNS肿瘤分类方法，但目前的金标准技术——Infinium MethylationEPIC（EPIC）芯片——在实际应用中面临成本高、周转时间长、需批量处理样本等局限。牛津纳米孔技术（ONT）的长读长测序有望将甲基化分析与全面的基因组特征分析整合到单一检测中，并提供实时数据获取的可能。然而，该技术在儿童CNS肿瘤诊断相关的多种分子特征以及不同甲基化分类器上的综合表现尚不完全清楚。因此，本研究旨在系统评估长读长纳米孔测序在儿童CNS肿瘤整合分子诊断中的临床应用价值。

研究方法概述

研究人员选取了一个来自瑞典西约塔兰地区2013-2025年间确诊的原发性CNS肿瘤患儿临床连续队列，最终纳入20例具有新鲜冷冻肿瘤样本、且已有相应Illumina短读长测序和DNA甲基化芯片数据的病例，涵盖胶质瘤、室管膜瘤和髓母细胞瘤三大类。关键技术方法包括：采用ONT PromethION平台进行长读长纳米孔测序；使用Dorado软件进行碱基识别和5-甲基胞嘧啶（5mC）/5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）修饰检测；利用Lumos工作流程进行肿瘤-only基因组分析，包括使用Clair3和DeepSomatic进行小变异检测、Severus进行结构变异（SV）检测、Wakhan进行拷贝数变异（CNV）分析和倍性/纯度估计；使用多个纳米孔甲基化分类器（MNP-Flex、Rapid-CNS²、Sturgeon、NanoDx、PanNanoDx、M-PACT）进行诊断分类，并与Epignostix芯片分类器对比；通过降采样分析评估测序深度对分类性能的影响。

研究结果

1. 长读长纳米孔测序在儿童CNS肿瘤中的性能

纳米孔测序在所有肿瘤组中生成了稳健的数据，平均N50读长为7.79 kb，每次运行平均产生126 Gb数据，对应约40x的平均基因组覆盖度。比对至人类参考基因组后覆盖度略有下降，其中弥漫性胶质瘤的变异最大。

2. 长读长纳米孔测序实现整合全基因组和单倍型特异性拷贝数分析

纳米孔衍生的CNV谱与甲基化芯片谱高度一致，中位Pearson相关系数为0.816。匹配的纳米孔CNV谱在20例样本中有18例（90%）与对应的芯片谱相关性最高。此外，纳米孔测序通过长读长定相实现了单倍型特异性拷贝数分析，可区分等位基因失衡和杂合性缺失（LOH）。

3. 跨平台临床相关靶向变异证据

在Illumina共识检测的78个临床相关靶向变异中，74个（95%）在纳米孔数据中找到了证据，但仅有53个（68%）被精确恢复为高置信度纳米孔检出。纳米孔对单核苷酸变异（SNV）的精确高置信度恢复率（75%）高于对小插入缺失（INDEL）（20%），但所有INDEL经额外审查后均显示纳米孔证据。变异等位基因频率（VAF）与跨平台恢复率正相关，低VAF变异是跨平台不一致的主要挑战。

4. 结构变异检测与跨平台断点重叠

Illumina和纳米孔测序检出的SV谱在数量和大小分布上存在显著差异。大多数样本中，双向断点重叠率很低，仅一例高度重排的样本（GU-pBT-124）显示出较高重叠。对于大于等于100 kb的事件，重叠率有所提高。

5. 纳米孔甲基化诊断分类

总体而言，纳米孔甲基化分类与WHO CNS5诊断高度一致，MNP-Flex和Rapid-CNS²的符合率达100%，M-PACT为95%，其他三个分类器为90%。室管膜瘤、髓母细胞瘤和毛细胞型星形细胞瘤在所有分类器中均获得一致性分类，而弥漫性胶质瘤（尤其是CMMRD相关病例）的变异性较大。分类器的评分/置信度水平差异很大，但与诊断准确性并无直接对应关系。

6. 不同测序深度的分类性能

诊断符合率在1x至>30x的测序深度范围内基本保持稳定（90-100%），但达到高置信度阈值的比例随深度增加而变化，且这种变化因分类器而异。结合5mC+5hmC谱通常比单独使用5mC谱获得更高或相似的分类评分。

讨论与结论

本研究证明，纳米孔长读长测序能够在单次检测中实现儿童CNS肿瘤的整合分子表征，提供序列变异、SV、CNV和甲基化分类等多层次临床相关信息。然而，不同基因组特征和肿瘤类型与现有方法的符合程度存在差异。拷贝数谱的跨平台相关性良好（中位r=0.816），但受限于拷贝数平坦型谱的动态范围。小变异的跨平台证据率高，但精确恢复率受限于生物信息学处理和VAF等因素。SV的重叠率较低，可能反映了技术差异和空间肿瘤异质性的共同影响。甲基化分类与WHO CNS5诊断高度一致，但弥漫性胶质瘤的分类变异性较大，凸显了该类肿瘤的表观遗传异质性和罕见亚型在训练集中代表性不足的问题。值得注意的是，分类器评分的高低并不直接等同于诊断准确性。降采样分析表明，即使在较低测序深度下，诊断符合率依然很高，这支持了缩短测序时间的可行性，但所需深度取决于所选分类器。

研究结论：长读长纳米孔测序分析能够实现对儿童CNS肿瘤的整合分子表征。跨平台比较显示，拷贝数谱的中位相关性为r=0.816，并且纳米孔证据覆盖了Illumina检测到的78个临床相关小变异中的74个（95%），而SV分析显示两种测序方法之间的断点重叠有限。尽管分类器特定的评分分布存在差异，但甲基化分类结果与所有评估的纳米孔分类器下的WHO CNS5诊断高度一致。虽然对于弥漫性胶质瘤等异质性肿瘤仍存在挑战，但这些发现支持将多种诊断模式整合到一个基于纳米孔的工作流程中的可行性。未来需要在更大、更多样化的诊断队列中进行前瞻性研究，以进一步确立长读长纳米孔测序在常规临床实践中的作用。