B类CpG寡脱氧核苷酸（B-CpG）简单混合增强mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗诱导的T细胞应答与抗肿瘤效应

《International Journal of Pharmaceutics》：Enhancing mRNA-lipid nanoparticle vaccine-induced T cell responses by simple supplementation with class B CpG oligodeoxynucleotides

　　

B类CpG寡脱氧核苷酸（B-CpG）增强mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗的T细胞诱导与抗肿瘤效应；B-CpG通过白细胞介素-12（IL-12）增强CD8⁺ T细胞诱导；B-CpG损害mRNA-LNP摄取并降低抗原表达；B-CpG吸附于mRNA-LNP上，显著改变其颗粒特性。

研究背景与问题：mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗在SARS-CoV-2疫情防控中表现出高效性，可诱导中和抗体及T细胞应答；疫苗诱导的T细胞对重症预防具有意义。mRNA癌症疫苗需高频、高剂量给药以诱导肿瘤抗原特异性T细胞，且疗效仍有限。佐剂可激活固有免疫、促进抗原提呈并增强T细胞诱导，但将佐剂简单混合入现有mRNA-LNP平台能否增强疫苗效应、何种佐剂最优、是否加重反应原性以及佐剂与mRNA-LNP相互作用如何影响体内行为，仍缺乏系统评价。Haruki Hirata等因此筛选候选佐剂，并评估其增强T细胞、抗肿瘤效应及安全性，同时分析佐剂与mRNA-LNP的相互作用和机制。

研究内容与意义：研究人员首先筛选15种佐剂与mRNA-LNP混合后的T细胞增强作用，随后重点评价B类CpG寡脱氧核苷酸（B-CpG）对T细胞应答、抗肿瘤效应和安全性特征的影响，并解析其与mRNA-LNP的相互作用及IL-12依赖性。研究提示，B-CpG简单混合可增强mRNA-LNP疫苗诱导的T细胞和抗肿瘤效应，且比单纯提高mRNA剂量具有相对更有利的安全性；同时揭示佐剂吸附可改变LNP颗粒性质并降低抗原表达，为mRNA-LNP疫苗与佐剂联合策略的优化提供依据。

关键技术与方法：研究使用雌性C57BL/6J小鼠（购自Oriental Yeast Co., Ltd.）及E.G7-OVA、EL-4、B16-OVA细胞系（分别来自ATCC、RIKEN BRC、Sigma-Aldrich）；以N1-甲基假尿苷修饰mRNA并封装于SM-102或ALC-0315脂质纳米颗粒（LNP）；筛选15种佐剂，采用流式细胞术、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤实验、ELISA、RT-qPCR、纳米流式、超滤吸附分析、小鼠肿瘤模型、CD4⁺/CD8⁺ T细胞耗竭及IL-12中和等。

研究结果：
3.1 B类CpG ODNs增强mRNA-LNP疫苗诱导的T细胞应答：研究人员将模型抗原卵清蛋白（OVA）mRNA-LNP与15种佐剂混合并两次肌内免疫，再以OVA_257–264和OVA_323–339肽重刺激脾细胞。流式结果显示，B类CpG ODN CpG K3和STING激动剂c-di-GMP显著增加IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞频率；CpG K3、c-di-GMP和TLR7激动剂CL307增加TNF-α⁺ CD8⁺及IFN-γ⁺ CD4⁺ T细胞频率；A类CpG ODN D35及其他多数佐剂无效，QS-21反而降低T细胞和抗体应答。其他B类CpG ODN ODN1826可重现增强作用，而无TLR9激活能力的CpG K3 GC及A类ODN1585无效；ALC-0315配方的mRNA-LNP与CpG K3联用亦增强T细胞。CTL实验显示，CpG K3佐剂组CD8⁺ T细胞对E.G7-OVA杀伤更强，对不表达OVA的EL-4无杀伤。

3.2 B-CpG佐剂mRNA疫苗比高剂量mRNA疫苗更有效且更安全：比较1 μg mRNA-LNP单独或联合B-CpG与3、10 μg单独免疫，1 μg联合B-CpG诱导的IFN-γ⁺ CD8⁺、TNF-α⁺ CD8⁺和IFN-γ⁺ CD4⁺ T细胞应答强于任何剂量的单独疫苗。安全性分析显示，B-CpG联合组IFN-α和IL-6水平低于10 μg单独组，IFN-γ高于其他组；体重下降轻于10 μg组；肝组织可见炎性细胞浸润，但无10 μg组所见肝细胞变性；AST低于10 μg组，ALT与1 μg或10 μg组无显著差异；第3天细胞因子、体重和生化指标多恢复。结论为B-CpG可在较低mRNA剂量下更高效且相对安全地增强T细胞。

3.3 B-CpG增强mRNA疫苗抗肿瘤效应：预防性B16-OVA和E.G7-OVA模型中，mOVA联合B-CpG与mOVA单独均实现肿瘤完全排斥并维持生存，而对照mRNA联合B-CpG不能抑制肿瘤。治疗性B16-OVA模型中，B-CpG联合mOVA比mOVA单独更强抑制肿瘤生长并呈生存延长趋势；E.G7-OVA模型中mOVA单独未能控制肿瘤，B-CpG联合显著抑制肿瘤进展并延长生存。肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）分析显示B-CpG联合组CD8⁺ TIL及抗原特异性CD8⁺ TIL增加；CD4⁺ T细胞耗竭不影响抗肿瘤效应，CD8⁺ T细胞耗竭则消除抗肿瘤效应，提示主要依赖CD8⁺ T细胞。

3.4 B-CpG损害mRNA-LNP摄取并降低抗原表达：引流淋巴结（dLN）中迁移性树突状细胞（mDC）和驻留性DC（rDC）数量及CD86平均荧光强度在mOVA单独与B-CpG联合组间无显著差异，肽-主要组织相容性复合体I类复合物（pMHC I）提呈呈降低趋势。荧光素酶mRNA-LNP实验显示，B-CpG使注射部位和次级淋巴器官抗原表达约降低10倍；DiD标记LNP与tdTomato mRNA实验显示B-CpG降低DC对LNP的摄取和抗原表达。无佐剂活性的B-CpG GC同样降低抗原表达，提示与核酸本身有关。超滤和纳米流式显示B-CpG吸附于mRNA-LNP表面；吸附后粒径略增、zeta电位显著降低。先注射mRNA-LNP、1分钟后再注射B-CpG的Separate条件可部分恢复rDC摄取和抗原表达。结论为B-CpG吸附改变颗粒性质，降低mRNA-LNP摄取和抗原表达。

3.5 B-CpG通过IL-12增强CD8⁺ T细胞诱导：RT-qPCR显示B-CpG联合mRNA疫苗使注射部位和dLN中Il12b表达约升高10倍；血浆IL-12p70升高。IL-12中和抗体实验显示，IL-12中和对mOVA单独组影响很小，但使B-CpG联合组抗原特异性CD8⁺ T细胞诱导降至mOVA单独组水平。结论为B-CpG通过促进IL-12产生增强CD8⁺ T细胞诱导。

3.6 B-CpG比IL-12-mRNA补充更安全地增强CD8⁺ T细胞诱导：将1 μg IL-12-mRNA-LNP与mOVA共给，可重现B-CpG联合组相当的IFN-γ⁺和TNF-α⁺ CD8⁺ T细胞应答；但mIL-12组血浆、肌肉和dLN中IL-12水平分别比B-CpG组高100倍以上、约1000倍和10倍以上。mIL-12组第1天IFN-α和IFN-γ更高，第3天IFN-γ和IL-6仍高，体重下降和AST/ALT升高持续至第3天；B-CpG组则多已恢复。结论为B-CpG以较低IL-12水平获得等效CD8⁺ T细胞增强，并具有相对更有利的安全性。

讨论与结论：讨论指出，B-CpG仅通过混合即可增强T细胞，且不同B类CpG ODN序列及不同LNP组成均可见效，具有平台适用性；其他佐剂效果有限与Th2偏向、mRNA-LNP自身激活重叠通路、QS-21表面活性破坏LNP及A/B类CpG诱导IL-12差异等有关。临床mRNA癌症疫苗常需高剂量且反应原性较高，B-CpG联合未明显增加IFN-α、IL-6仅轻升，可能解释其相对较低反应原性。B-CpG组IL-12水平远低于mIL-12组但T细胞应答等效，提示其他细胞因子可能协同IL-12。抗原表达降低但T细胞增强，说明抗原表达并非CD8⁺ T细胞诱导的唯一决定因素；Separate给药可改善抗原表达。讨论还提出B-CpG吸附可能由LNP脂质组分局部电荷不对称（偶极矩）介导，但驱动因素尚未明确；局限包括仅使用OVA抗原、未评估肿瘤相关抗原的免疫耐受及吸附机制未完全解析。

研究结论翻译：本研究表明，添加B类CpG ODN以IL-12依赖方式增强mRNA疫苗诱导的T细胞应答和抗肿瘤效应。该方法只需将佐剂与现有mRNA-LNP疫苗平台混合即可实施，技术上可行。研究人员认为，该策略可有效增强T细胞诱导，并比单纯增加mRNA-LNP疫苗剂量具有更有利的安全性特征。然而，研究结果也提示，佐剂与mRNA-LNP的相互作用此前很少受到关注，可影响LNP递送性能并降低抗原表达。尽管未来需研究这些相互作用如何导致抗原表达降低并优化LNP组成等参数，研究结果有望促进开发在保持可接受安全性的同时实现更高疗效的mRNA疫苗。