《Alzheimer's Research & Therapy》：Short-interval variability and test-retest reliability of Alzheimer’s disease plasma biomarkers in a clinically heterogenous cohort
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背景：评估阿尔茨海默病（AD）相关血浆生物标志物的短期个体内变异性和重测可靠性，对于其在现实世界临床实施及研究中的结果解读具有重要意义。本研究旨在评估核心AD血浆生物标志物及其拟定比值的短期变异性和可靠性，并评价一个更广泛的蛋白质组学检测组合。方法：从纳入观察
背景：评估阿尔茨海默病（AD）相关血浆生物标志物的短期个体内变异性和重测可靠性，对于其在现实世界临床实施及研究中的结果解读具有重要意义。本研究旨在评估核心AD血浆生物标志物及其拟定比值的短期变异性和可靠性，并评价一个更广泛的蛋白质组学检测组合。方法：从纳入观察性研究项目的92名参与者中，每人采集两份连续血浆样本，采样间隔从30分钟至三个月不等。研究人员对三种免疫检测平台（Lumipulse G血浆p-tau217；Fujirebio公司，NULISAseq中枢神经系统疾病检测组合及NULISAqpcr AD 5-Plex检测组合；Alamar Biosciences公司）所检测的131种生物标志物进行了重测可靠性和个体内变异性评估。研究人员随后评估了用于AD概率诊断分类的双临界值方法的稳定性，并检验了个体内变异性是否与样本间间隔（两次连续血样采集之间的时间）相关。结果：本研究所评估的所有核心AD血浆生物标志物（Aβ42、BD-p-tau181、BD-p-tau217、BD-p-tau231、p-tau181、p-tau217、p-tau231、GFAP和NfL）均表现出强相关性（r ≥ 0.79）和高可靠性（ICC ≥ 0.84）。核心AD血浆生物标志物的个体内变异性为中低水平。采用经验证的血浆p-tau217双临界值方法，大多数个体（92%）在两个时间点均保持在同一诊断类别（高/不确定/低），且没有个体跨越两个边界（即从高AD概率分类变为低AD概率分类，反之亦然）。对于大多数分析物，在校正年龄和性别后，个体内变异性与样本间间隔无显著关联，但核心AD血浆生物标志物NfL确实存在显著关联。结论：尽管核心AD血浆生物标志物在短时间间隔内表现出有限变异性和高可靠性，但其他中枢神经系统（CNS）相关生物标志物显示出更大的变异性，这可能对关联研究和临床应用中的结果解读具有重要意义。
**论文解读**
**一、研究背景与目的**
血液生物标志物（BBMs）因其无创、便捷且成本效益高的特点，已成为评估阿尔茨海默病（AD）病理改变的重要工具，并越来越多地应用于AD的诊断、预后判断以及疾病修饰疗法（DMTs）的入组筛选。随着血液生物标志物向临床实践转化，理解可能影响测量结果的各类因素变得至关重要。尽管诸多研究已对采血前因素（如饮食、昼夜节律等）和临床混杂因素（如体重指数、慢性肾脏病）的影响进行了探讨，但关于血浆生物标志物在短时间间隔内（如数小时至数月内）的个体内生物学变异性和重测可靠性的研究仍相对有限。已有少部分研究基于单一或低通量免疫检测平台报告了相关变异性和可靠性数据，然而，目前尚无研究评估高通量蛋白质组学平台（如NULISA技术）在此背景下的表现。为了促进血浆生物标志物在临床和研究中的可靠应用，明确其短期内的测量稳定性，并探索不同检测平台（单一、低通量、高通量）之间的性能差异，本研究旨在系统评估核心AD血浆生物标志物及更广泛中枢神经系统（CNS）相关生物标志物的短期个体内变异性和重测可靠性，并进一步检验基于血浆p-tau217的双临界值诊断分类方法的稳定性以及采样间隔对变异性的潜在影响。
**二、研究设计与核心发现概述**
研究人员依托伦敦大学学院痴呆研究中心（Dementia Research Centre, University College London）开展了一项前瞻性重测可靠性研究，共纳入92名参与者，包括AD患者、其他神经退行性疾病患者、常染色体显性遗传AD（ADAD）无症状突变携带者（AMC）及健康对照者。每位参与者按照研究方案提供了两份连续血浆样本，采样间隔从30分钟至三个月不等（中位间隔为85分钟）。研究人员分别采用了Fujirebio公司的Lumipulse G平台检测血浆p-tau217，Alamar Biosciences公司的NULISAseq CNS Disease Panel高通量平台检测131种CNS相关蛋白，以及NULISAqpcr AD 5-Plex平台定量检测BD-p-tau217、Aβ42、NfL、GFAP和APOE ε4。研究结果显示，所有核心AD血浆生物标志物（Aβ42、BD-p-tau217、GFAP、NfL和p-tau217）均表现出出色的重测可靠性（Spearman rho ≥ 0.80，ICC ≥ 0.92），个体内变异性（CVw）处于中低水平。基于血浆p-tau217双临界值方法，92%的个体在两次采样中保持了相同的AD概率诊断分类（高/不确定/低），未发现跨越两个分类边界的个体。此外，研究人员发现，对于大多数分析物，个体内变异性与采样间隔无关，但核心标志物NfL除外，其变异性随采样间隔延长而显著增加。本研究的核心意义在于首次评估了高通量蛋白质组学平台NULISAseq CNS Disease Panel在短期内的重测可靠性，证实核心AD标志物在多种检测平台上具有高度稳定性，同时指出部分CNS相关标志物（如α-突触核蛋白）的变异性可能影响其在关联研究中的解读，建议临床应用时需结合具体平台特性和待测标志物的短期波动特性进行谨慎判断。
**三、关键技术方法概要**
本研究采用了三种技术平台对血浆生物标志物进行测量：Lumipulse G1200全自动免疫分析平台（Fujirebio），用于定量检测血浆p-tau217；NULISAseq CNS Disease Panel（Alamar Biosciences），一种基于核酸连接免疫夹心分析（NULISA）技术的高通量蛋白质组学平台，可同时检测131种CNS相关分析物，其检测结果以NULISA蛋白定量（NPQ）单位报告；NULISAqpcr AD 5-Plex检测（Alamar Biosciences），采用定量聚合酶链反应（qPCR）对特定AD相关标志物（BD-p-tau217、Aβ42、NfL、GFAP和APOE ε4）进行绝对定量。统计方法方面，研究人员使用Spearman相关系数（rho）和组内相关系数（ICC）评估重测可靠性，使用个体内变异系数（CVw）评估个体内变异性，并通过线性回归模型在校正年龄和性别后分析采样间隔对变异性的影响，多重检验校正采用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）方法。
**四、主要研究结果**
（一）Lumipulse G和NULISAqpcr AD 5-Plex平台核心AD血浆生物标志物的重测可靠性
基于Lumipulse G平台（N=92）和NULISAqpcr AD 5-Plex平台（N=80）的检测数据，核心AD生物标志物（Aβ42、BD-p-tau217、GFAP、NfL和p-tau217）均表现出高可靠性，Spearman rho≥0.80，ICC≥0.92。个体内变异性方面，NfL的CVw为9.7%（95% CI 7.8%–11.5%），而BD-p-tau217的CVw最高，为22.0%（95% CI 17.6%–26.5%）。值得注意的是，Lumipulse G平台检测的p-tau217与NULISAqpcr平台检测的BD-p-tau217在可靠性上相当（rho均为0.95），但Lumipulse平台的个体内变异性更低（CVw 11.2%对22.0%）。BD-p-tau217/Aβ42比值与BD-p-tau217单独测量相比，并未改善重测可靠性，也未显著降低个体内变异性。此外，亚组分析显示部分核心标志物在不同诊断组之间的ICC或CVw存在显著差异，但因各组样本量较小，该结果的解读应保持谨慎。
（二）NULISAseq CNS Disease Panel平台的重测可靠性评估
在检测131种CNS相关分析物的高通量NULISAseq平台上，研究人员根据预设阈值进行分类：74种分析物表现出强相关性（Spearman rho≥0.75），43种表现出中等相关性（rho=0.46–0.74），14种相关性较低（rho≤0.45）。重测可靠性方面，78种分析物具有高ICC（≥0.75），37种具有中等ICC（0.46–0.74），16种ICC较低（≤0.45）。大部分分析物（132种中的101种）的CVw低于20%。其中，Aβ42/Aβ40比值表现出比单独Aβ42更高的可靠性（Aβ42/Aβ40的ICC为0.95，Aβ42的ICC为0.84），且个体内变异性相当。
（三）跨平台相关性分析
Lumipulse G平台与NULISAseq平台检测的p-tau217水平呈强正相关（Spearman rho=0.88，p<0.001），NULISAseq平台与NULISAqpcr平台检测的BD-p-tau217亦表现出高度跨平台一致性（Spearman rho=0.90，p<0.001），证实不同检测平台对核心AD标志物的测量具有良好的一致性。
（四）AD概率分类的跨时间点稳定性
采用既往独立队列推导的血浆p-tau217双临界值（>0.422 pg/mL为高AD概率，0.153–0.422 pg/mL为不确定，<0.153 pg/mL为低AD概率），92名个体在两次时间点上的分类结果显示，92%（85/92）的个体保持相同分类，仅8%（7/92）跨越了一个临界值边界，且无AD临床诊断个体跨越边界。此外，对两次p-tau217测量值取算术平均值并未减少被归为“不确定”类别的个体比例。
（五）采样间隔对个体内变异性的影响
线性回归分析在校正年龄和性别后显示，经FDR校正，NULISAseq平台上30种分析物和NULISAqpcr平台上1种分析物（即核心标志物NfL）的个体内变异性与较长的采样间隔存在显著正相关，提示NfL的短期变异性可能反映了其作为动态神经退行性标志物的生理敏感性。
**五、总结与讨论**
本研究全面评估了多种免疫检测平台（单一、低通量和高通量）测量的血浆生物标志物在短时间间隔内的个体内变异性和重测可靠性，是首个对高通量NULISAseq平台进行此类评估的研究。讨论部分指出，核心AD血浆生物标志物在短间隔内表现出优秀且稳定的重测性能，但比值类指标并未一致性地提升检测可靠性，其临床应用应基于明确的增量临床价值证据。基于双临界值分类法的稳定性分析提示，对临界值附近的个体进行短期重复检测可能提供的额外诊断信息有限。而NfL变异性随采样间隔的适度增加，可能与其反映短期生理变化有关。此外，包括α-突触核蛋白和TARDBP在内的部分CNS相关标志物显示出较低的可靠性和较高的变异性，在关联研究中解读这些标志物时应特别谨慎。研究结论指出：核心AD生物标志物在各检测平台上表现出强相关性、高重测可靠性和低个体内变异性；同时提示，对于短期变异性尚未充分明确的生物标志物，在将其与疾病状态进行关联解读时应保持审慎，未来需在更大规模、基于生物标志物定义的队列中重复验证，并充分考虑空腹状态和采样时间等影响生理波动的因素。
