《JHEP Reports》：Patient-Derived Organoids from cryopreserved tissue can represent clinically relevant tools for drug testing in Biliary Cancer
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背景与目的：患者来源类器官（patient-derived organoids，PDO）是来源于癌症组织的三维培养物。虽然PDO能够复制特定患者的癌症形态和药物敏感性，但其临床应用受限于缺乏与临床试验的整合。研究人员旨在确定胆管癌（cholangiocarci
背景与目的：患者来源类器官（patient-derived organoids，PDO）是来源于癌症组织的三维培养物。虽然PDO能够复制特定患者的癌症形态和药物敏感性，但其临床应用受限于缺乏与临床试验的整合。研究人员旨在确定胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）患者中PDO的建立率，并建立一个从冷冻保存组织生成PDO的方案。方法：研究人员建立了来源于肿瘤组织的PDO生物库（N=26）。在小鼠中优化了从冷冻保存组织建立类器官的方案，在人类PDO中进行了确认，并在多个机构间进行了验证。结果：尽管研究人员最初纳入了多种亚型，包括胰腺癌（N=7）、CCA（N=11）、十二指肠癌（N=2）和壶腹癌（N=6），但研究人员将方案优化为偏向胆道表型，肠道表型癌症的建立效率降低。总共建立了15个PDO（58%）；在CCA队列中，效率为75%（11例中8例）。通过病理审查确认类器官的肿瘤来源，时间在临床相关的时间范围内[中位数：1.6个月（0.43-4.83个月）]。对于具有不良预后因素（如神经周围浸润、血管浸润、淋巴结状态和切除边缘）的CCA，PDO成功建立没有数值上的富集（p>0.05）。药物筛选数据从组织采集起平均3个月内可得（范围：1.4-3.4个月）。从冷冻保存组织建立PDO在67%的病例中成功，并且与从新鲜组织建立的类器官相比，保持了形态、分泌功能、动力学和动态生长模式、转录组学和药物敏感性。结论：冷冻保存组织可以促进PDO建立的集中化，从而将胆道PDO整合到多中心试验中。
**论文解读：冷冻保存组织促进胆道癌症患者来源类器官的建立与药物测试**
胆道癌（biliary tract cancer，BTC）是一类侵袭性强、预后较差的恶性肿瘤。目前BTC的精准肿瘤学策略主要依赖肿瘤分子谱进行患者分层，然而约半数患者未检测到可干预的分子靶点，且针对靶点的治疗反应存在异质性；化疗仍是治疗基石，但缺乏有效的预测性生物标志物。患者来源类器官（patient-derived organoid，PDO）作为三维（three-dimensional，3D）培养模型，能够保留患者肿瘤的形态学和药物敏感性特征，具有指导药物选择的潜力。然而，PDO在BTC中的应用仍处于早期阶段，主要原因包括：缺乏BTC中PDO建立效率的可靠数据；新鲜组织需在数小时内处理，而BTC罕见，常需多中心合作，但许多中心缺乏开展PDO研究的专门实验室；这些因素限制了PDO在临床试验中的整合。因此，本研究旨在评估BTC患者中PDO的建立效率，并开发从冷冻保存组织生成PDO的方案，以支持多中心试验的设计。
研究人员从2020年至2023年收集了26例胰胆癌患者的肿瘤组织（其中胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）11例、胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）7例、壶腹癌6例、十二指肠癌2例），建立了PDO生物库。通过优化的类器官培养方案和一种针对胆道干细胞的冷冻保存溶液，在小鼠模型中验证了冷冻组织建立类器官的可行性，随后在人类组织及跨机构样本中进行了确认。结果显示，整体PDO建立率为58%（若排除肠道表型则为61%），CCA队列中为75%。成功建立的PDO与患者的不良预后因素无显著关联。从冷冻保存组织建立PDO的成功率为67%，且所获PDO在形态、分泌功能、生长动力学、转录组学和药物敏感性方面与新鲜组织来源的PDO高度一致。药物敏感性数据平均可在组织采集后3个月（范围1.4-3.4个月）内获得。这些结果为冷冻保存组织用于PDO服务的集中化提供了证据，有望促进胆道PDO进入多中心临床试验。
**关键技术方法**：研究使用了来自英国国家卫生服务（NHS）大格拉斯哥和克莱德健康委员会以及意大利Humanitas医院的26+1例手术切除或活检组织（包括24例切除、2例活检，以及1例来自意大利）。主要技术包括：基于基质胶（Matrigel）的三维培养建立PDO；采用含有干细胞培养基、透明质酸、人血清白蛋白和二甲基亚砜的冷冻保存溶液对组织进行冷冻，并建立快速解冻、消化和培养方案；通过苏木精-伊红染色和免疫组化（细胞角蛋白CK7/CK19/CK20、SOX9）进行病理学确认；使用活细胞成像系统（IncuCyte）监测类器官生长动力学；采用标准化疗药物（如5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康、吉西他滨、顺铂和奥拉帕尼）进行药物敏感性测试（CellTiter-Blue细胞活力检测）；通过RNA测序进行转录组分析；通过PamGene技术进行激酶组分析；通过Ion AmpliSeq癌症热点v2 panel进行基因组分析。这些方法共同用于评估类器官的肿瘤来源、功能和相关分子特征。
**研究结果**
**1. PDO建立效率及临床病理因素关联**：通过回顾性分析26例连续纳入的胰胆癌患者，整体类器官形成率为69%（18/26），经病理确认的PDO占58%（15/26）。当排除肠道表型肿瘤后，成功率升至61%。在CCA亚型中，成功率分别为肝内胆管癌75%和肝外胆管癌71%。药物敏感性数据平均在2.67个月获得。统计显示，PDO建立成功与神经周围浸润、血管浸润、淋巴结状态和切除边缘等不良预后因素无显著富集（p>0.05）。然而，新辅助化疗暴露在未能成功建立PDO的胰腺癌病例中更常见（71% vs 36%，p=0.15），提示化疗可能影响类器官生长。
**2. 冷冻保存组织建立PDO的可行性（小鼠模型）**：使用遗传工程小鼠胆管癌模型（Ck19-CreER;KrasG12D/+;Ptenfl/fl），从新鲜和冷冻保存的肿瘤组织分别建立类器官。两组类器官在长期培养中增长率相似，形态和胆道标志物（CK7、CK19、CK20、PAS、SOX9）表达一致，活细胞成像显示生长动力学参数无差异。RNA测序显示新鲜与冷冻组织来源类器官转录组有97%相似性，药物敏感性也相同。
**3. 人类冷冻保存组织PDO的建立与表征**：对9例胰胆癌患者组织进行配对分析，6例（67%）成功从冷冻组织建立PDO。失败病例包括低癌细胞含量、新辅助化疗后和1例肝外胆管癌。配对的新鲜和冷冻组织来源类器官在生长动力学、形态和标志物表达上相似。药物敏感性在患者间存在异质性，但在同一患者内新鲜和冷冻来源的类器官反应一致。转录组分析显示，差异表达基因仅约0.1%，干细胞评分无显著变化；通路分析仅p53信号通路明显改变；激酶组分析显示仅少数激酶活性有差异。
**4. 药物敏感性与患者临床结局的相关性**：通过比较患者临床病程（如无复发生存期、疾病进展时间）与对应类器官的体外药物敏感性，观察到具参考价值的关联：例如对FOLFOX方案高敏感的PDO对应患者接受该方案后获得较长无复发生存期；吉西他滨-顺铂治疗的患者中，进展时间较长者其类器官对吉西他滨和联合方案更敏感。该结果基于少数病例，需进一步验证。
**5. 跨国际中心验证**：从意大利Humanitas医院获取冷冻保存的胆道肿瘤组织，运输至英国格拉斯哥大学实验室，成功建立PDO。该类器官在形态、生长率、标志物表达和药物反应方面与本地样本相似，并在患者开始辅助治疗前提供了药物测试结果。该患者术后接受卡培他滨辅助治疗5个月后局部复发，后转为吉西他滨-顺铂方案，但因耐受差和缺乏客观反应于3个月后停药，最终接受手术切除。
**讨论总结与结论**：讨论部分指出，本研究表明PDO建立效率与前期的单中心研究相比更具普遍性，独立于多数临床病理因素。新辅助化疗可能是降低建立率的因素，因此PDO整合到新辅助治疗研究需谨慎。病理学确认在临床相关时间框架内完成（中位47天），药物敏感性检测可在9周内完成，支持PDO应用于辅助治疗或二线治疗场景。冷冻保存组织的成功建立使集中化服务成为可能，有利于多中心临床试验。未来可通过多细胞assembloids纳入免疫细胞来扩展免疫治疗的应用。研究结论翻译如下：冷冻保存组织可以促进PDO建立的集中化，从而将胆道PDO整合到多中心试验中。
