《Lab on a Chip》：Mating cell traps to silica microbands for picoliter thin layer chromatography (pTLC) assay of phosphoinositide metabolism in single cellsOpen Access
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磷脂酰肌醇信号通路在单个肿瘤细胞的存活和增殖中发挥关键作用，因此需要发展单细胞水平的磷脂酰肌醇信号检测方法。在本工作中，研究人员将细胞捕获器与整体式二氧化硅微带对齐（皮升级薄层色谱，pTLC），以大于70%的效率将单个细胞定位于阵列中的微带上。利用带有细胞捕获
磷脂酰肌醇信号通路在单个肿瘤细胞的存活和增殖中发挥关键作用，因此需要发展单细胞水平的磷脂酰肌醇信号检测方法。在本工作中，研究人员将细胞捕获器与整体式二氧化硅微带对齐（皮升级薄层色谱，pTLC），以大于70%的效率将单个细胞定位于阵列中的微带上。利用带有细胞捕获器的pTLC，在超过900个单细胞中实现了BODIPY荧光素标记的磷脂酰肌醇4-磷酸（BODIPY FL PI4P）代谢产物的分离与定量。细胞内BODIPY FL PI4P的主要代谢产物为BODIPY FL磷脂酰肌醇（PI），这很可能归因于肌动蛋白抑制因子（SAC）家族磷脂酰肌醇磷酸酶的作用。一种次要代谢产物的迁移时间与BODIPY荧光素标记的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（BODIPY FL PI(4,5)P2）相近。在K562（慢性髓系白血病）细胞中，平均59%±1%的BODIPY FL PI4P被去磷酸化；而在MM1S（多发性骨髓瘤）细胞中观察到了显著更高的去磷酸化水平（62%±1%）。相比之下，侵袭性较强的Kasumi-3（未分化急性髓母细胞白血病）细胞对PI4P报告分子的代谢（66%±2%）显著高于其他细胞系。所有被评估的细胞系均显示出大量单细胞的代谢行为远离群体平均值，揭示了细胞群体中基于单细胞的行为全貌。对捕获的Kasumi-3细胞进行免疫检测后接续pTLC，证明了将其他检测方法与pTLC联合使用的潜力。
脂质信号通路及其相关激酶和磷酸酶在调控细胞生存与死亡中至关重要。磷脂酰肌醇信号通路利用磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI(4,5)P
2）产生多种脂质第二信使，调控细胞运动、黏附、形态、增殖与存活。磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）既可在磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶（PIP5K）作用下磷酸化为PI(4,5)P
2，也可被肌动蛋白抑制因子（SAC）家族磷酸酶去磷酸化为磷脂酰肌醇（PI）。PI4P代谢增强与多种癌症不良预后相关，PI4K抑制剂可抑制癌细胞增殖。单细胞研究揭示了肿瘤细胞存在显著的遗传和代谢异质性，而现有检测单细胞脂质代谢酶活性的方法，如质谱、拉曼光谱、抗体检测和荧光显微术，分别受灵敏度不足、特异性差、脂质免疫原性低以及无法鉴定代谢物等限制。皮升级薄层色谱（pTLC）已成为单细胞脂质代谢分析的重要工具，但存在细胞放置速度慢、使用微带数量少、带间迁移时间差异大等问题。因此，需要发展高通量、可重复且可多指标联用的单细胞磷脂酰肌醇代谢分析方法。
研究人员将PDMS细胞捕获器与pTLC芯片整合，以超过70%的效率捕获单个细胞，优化了4种BODIPY荧光标记磷脂酰肌醇的分离，并引入固定后加载的PA-Rhodamine B作为内标以提高重复性。利用BODIPY FL PI4P作为报告分子，研究人员在K562（慢性髓系白血病）、MM1S（多发性骨髓瘤）和Kasumi-3（急性髓母细胞白血病）共900多个单细胞中定量了PI4P代谢，并通过免疫染色联合pTLC检测了Kasumi-3细胞的CD33/CD34表面标志与PI4P代谢。结果显示不同细胞系的PI4P去磷酸化水平存在差异，单细胞代谢高度异质；该平台可低成本、平行、多指标地分析单细胞脂质信号。
主要关键技术方法包括：（1）采用光刻和氢氟酸湿法刻蚀在钠钙玻璃上制作40条开放微通道，填充硅溶胶-凝胶前体，经聚合、煅烧形成整体式二氧化硅微带pTLC芯片；（2）通过深反应离子刻蚀制作硅模具，浇铸PDMS薄膜形成20 μm通孔阵列细胞捕获器，与PDMS通道块组装后对准到pTLC微带上；（3）将BODIPY FL PI4P与shuttle PIP载体2共同孵育载入细胞，固定后用PA-Rhodamine B标记内标，再经pTLC分离和荧光成像定量；（4）采用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）鉴定细胞裂解物中的代谢产物；（5）对Kasumi-3细胞进行CD33/CD34免疫荧光染色后再进行pTLC。所用细胞系K562、Kasumi-3和MM.1S均来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
pTLC enables reproducible separation of multiple phosphoinositides：研究人员将4种BODIPY FL标记的磷酸肌醇标准品与内标PA-Rhodamine B点样于微带并分离，发现分析物迁移速度在芯片内存在一定变异；以PA-Rhodamine B归一化后，各磷酸肌醇的迁移速度表现出高度重复性，相邻分析物间的分辨率均大于1，不同芯片间的峰面积和半峰宽无显著差异。BODIPY FL PI4P的检出限为0.05 amol。
Integration of cell traps to increase the single-cell capture rate：研究人员设计并制作了由PDMS薄膜上的微通孔阵列组成的细胞捕获器，通孔直径为20 μm，高宽比为1.25，并与pTLC微带精确对准。采用1 mm宽通道和1×10
6 cells/100 μL细胞密度可获得最优单细胞捕获效率；移除PDMS通道块后，已捕获细胞无损失。与压电喷墨打印相比，该方法实现了低成本、高度平行且高效的细胞放置。
Measurement of BODIPY FL PI4P metabolism in single cells by pTLC：K562和MM1S细胞载入BODIPY FL PI4P后，pTLC色谱显示绝大多数细胞含有两个峰，分别对应BODIPY FL PI和BODIPY FL PI4P；UPLC-MS证实这两个峰分别为BODIPY FL PI和BODIPY FL PI4P。少数细胞出现额外峰，其迁移时间与BODIPY FL PI(4,5)P
2和BODIPY FL PIP3相近。K562细胞平均将59%±1%的BODIPY FL PI4P转化为BODIPY FL PI，MM1S细胞为62%±1%，差异显著；单细胞转化率范围分别为17%–90%和18%–89%，表明代谢行为高度异质。报告分子总载入量与转化率之间未见明显依赖关系。
Measurement of BODIPY FL PI4P metabolism in stem-cell-like leukemic cells：Kasumi-3细胞中CD33阳性细胞占89%±4%，CD34阳性细胞占90%±3%。300个单细胞的检测显示，BODIPY FL PI4P转化为BODIPY FL PI的比例平均为66%±2%，范围15.1%–89.0%，显著高于K562和MM1S。结果表明，pTLC可将脂质信号通路分析与免疫表型检测相耦合，并提示侵袭性较强的Kasumi-3和MM1S细胞可能更依赖磷酸肌醇信号驱动恶性表型。
讨论部分指出，单细胞研究需要简单、低成本且能融入常规流程的捕获技术。研究人员将细胞捕获器与pTLC芯片整合，利用固定后载入PA-Rhodamine B的策略避免内标被代谢，从而提高了保留时间归一化的可靠性。关于肿瘤细胞异质性的数据具有意义，但尚不能据此推断正常细胞中PI4P代谢状况或PI通路对癌细胞生长的真实贡献，未来需要结合PI4P代谢相关酶敲除/敲低或过表达的细胞系进一步研究。研究结论可翻译为：该工作证明了pTLC平台能够以高通量、简便且多路复用的方式分析单细胞中的脂质代谢。
