基于液滴微流控的纳升级血凝试验用于流感病毒样颗粒（VLP）血凝活性快速灵敏检测

《Lab on a Chip》：Microdroplet hemagglutination assay for virus-like particle (VLP) quantificationOpen Access

　　

对病毒血凝活性的快速、灵敏评估对于疫苗开发和病毒分析具有重要意义，但传统血凝（HA）试验受处理时间长、试剂消耗高和终点判读主观等限制。在此，研究人员提出了一种液滴微流控平台，可将流感病毒样颗粒（VLP）的基于血凝的分析微型化并自动化。该系统整合标准T型结（T-junction）液滴发生器与蛇形混合通道（serpentine mixing channels），实现VLP与红细胞（RBC）的受控包封及液滴内快速混合。与传统静态HA试验相比，在所测试条件下，该微流控平台可在约60 s内提供基于聚集体大小的操作性终点，同时显著降低样本消耗。研究人员在不同RBC浓度、RBC/VLP比例、液滴大小和RBC样本新鲜度条件下系统评价了系统性能。在测试条件下，该平台在比传统孔板试验高8倍的样本稀释度下检测到血凝活性。这种提高的灵敏度使得能够评估低活性下游组分中的血凝活性，而这些组分可能低于传统HA试验的检测限，从而可能支持VLP疫苗生产过程中HA活性物质的监测及其回收。这些结果为评估VLP血凝活性和疫苗生物工艺监测提供了快速、低体积和可扩展微流控平台的基础。

研究背景与问题：传染病仍是全球发病和死亡的重要原因，流感在季节性流行期间每年造成约5亿例感染，甲型流感病毒因高毒力和高突变率而持续带来大流行威胁。有效防控不仅需要快速响应和疫苗部署，也需要持续监测和可靠的病毒检测方法。VLP（病毒样颗粒）是由病毒结构蛋白自组装形成的非感染性蛋白复合物，可模拟天然病毒的形态和抗原特征，但缺乏遗传物质，因而复制缺陷且生物安全性较高，已作为疫苗候选物和病毒检测研究中的替代物。病毒定量技术分为抗体依赖和抗体非依赖两类。抗体依赖方法如单径向免疫扩散（SRID）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和表面等离子体共振（SPR）依赖株特异性抗体；SRID对血凝素（HA）的检测限为3–5 μg mL^?1，但VLP脂质包膜会干扰HA在琼脂糖凝胶中的扩散，高颗粒浓度下HA蛋白易聚集，降低准确性。抗体非依赖方法依赖病毒刺突蛋白HA的活性，HA是免疫原性和病毒功能的关键指标；透射电子显微镜（TEM）可直接观察颗粒形态，但判读主观且样品制备复杂；流式细胞术和动态光散射（DLS）等基于尺寸的方法难以准确区分空衣壳或缺陷颗粒与完整病毒；液相色谱-质谱联用（LC–MS）可定量HA和神经氨酸酶（NA），但操作繁琐。因此，HA试验仍是评估流感病毒最常用的抗体非依赖方法，但传统HA试验依赖主观肉眼判读、试剂体积大、灵敏度和标准化不足。研究人员因此开展液滴微流控HA试验，以缩短读数时间并显著降低样本消耗；既往微流控血凝研究多集中于血型鉴定和血液分析，且常需复杂传感器、表面修饰或表面活性剂防止非特异性蛋白吸附，而本研究采用简单光学系统和硅油简单表面处理以减少蛋白黏附，简化制备并提高操作稳健性，系统考察病毒与RBC浓度、液滴大小、VLP类型和试剂新鲜度等参数，旨在降低研究及疫苗生产环境中的检测限（LOD），捕获传统HA检测可能遗漏的VLP相关物质，更好反映下游处理中的产物损失并支持VLP回收和疫苗工艺产量评估。

研究人员开展的研究及结论：研究人员构建了由Y型结、T型结液滴发生器和蛇形混合通道组成的液滴微流控平台，将VLP与RBC共包封，以显微录像和图像分析测定RBC聚集体尺寸随时间变化，并将聚集体尺寸达到平台定义为操作性成像终点；在考察RBC浓度、RBC:VLP比例、液滴尺寸、RBC新鲜度及不同VLP制备后，与传统96孔板HA试验比较。结果表明，在测试条件下该平台约60 s内给出操作性聚集体大小终点，反应体积为纳升级，并在所测试条件下检测到比传统孔板试验高8倍的样本稀释度；该平台可区分不同HA活性水平的VLP制备，具有用于VLP血凝活性功能表征和疫苗生物工艺中HA活性物质监测的潜力。作者同时指出，该试验测量的是血凝活性而非绝对VLP颗粒浓度，需独立颗粒定量建立二者关系。

关键技术方法（不超过250字）：采用软光刻制备PDMS（聚二甲基硅氧烷）微流控芯片，以Y型结合并VLP与RBC、T型结在硅油连续相中生成液滴，蛇形通道利用内部涡流增强混合；用压力驱动泵控流，单色CCD相机录像，MATLAB脚本抽帧，ImageJ进行二值化、阈值分割、边缘检测及ROI（感兴趣区域）分析聚集体面积；以标准96孔板HA试验作对照。VLP由Sf9细胞/重组杆状病毒表达系统制备，RBC为鸡RBC（Rockland），无人类样本队列。

研究结果：
微流控装置与操作性终点：装置分为T型结液滴生成段和蛇形混合段；VLP与RBC在Y型结汇合后于T型结生成液滴，HA与RBC表面结合导致RBC聚集。操作性终点定义为可见RBC聚集体形成且测量尺寸在液滴内达到平台，属于所用微流控条件下的非平衡稳态测量，而非传统孔板静态终点。每轮实验使用单芯片并记录20个液滴；约20 μm聚集体尺寸阈值用于区分凝集与未凝集细胞。有HA时聚集体在液滴前部积累，高稀释阴性对照无可见凝集且RBC分布较均匀；聚集尺寸随时间增加至平台，在所测试条件下约60 s达到平台。作者指出未在相同微流控条件下处理HA阴性对照，不能完全排除通道表面或液滴界面引起非特异性RBC聚集。

红细胞稀释对操作性终点和检测效率的影响：将RBC稀释至10%和50%，与含HA、NA和基质蛋白1（M1）的VLP储液在微滴内混合；在相同流动条件、VLP浓度和液滴大小下，较高RBC浓度产生更大聚集体，可能与RBC密度提供更多HA结合位点有关。10%和50% RBC约43 s达到操作性聚集体大小终点，未稀释100% RBC继续增长至约60 s。微流控系统可适应较宽RBC浓度并保持分析性能，R²=0.9448，p=0.000179；传统96孔板在高RBC浓度下因过度聚集和光学干扰难以准确分析，且未能显示可比的时间分辨读数。结论是RBC浓度影响聚集体大小和操作性终点时间。

不同RBC:VLP比例对凝集行为的影响：将RBC:VLP由1:1改为1:3，并调整压力以保持相似液滴大小和流速。1:3条件约32 s达到操作性终点，1:1约60 s；1:3最终聚集体更小，符合每液滴包封RBC数量减少，较早平台可能反映较大VLP体积分数和可用于聚集的RBC较少。作者将其报告为操作性成像终点变化，不解释为内在HA–RBC结合动力学加速，且与RBC浓度变化实验结果一致。

液滴大小对操作性凝集终点的影响：通过增加连续相压力并保持分散相压力恒定，生成约600 μm和900 μm液滴，使用相同RBC和VLP浓度。两种液滴大小均在约60 s达到操作性终点，说明在所研究尺寸范围内终点时间未受明显影响；900 μm液滴最终RBC聚集体更大，因较大液滴包封细胞更多。

红细胞新鲜度对血凝行为的影响：比较新鲜采集且在有效期内的RBC与EDTA管储存至过期的RBC，并采用两种液滴大小。新鲜RBC在两种液滴大小下约60 s达到终点，且聚集体较大，可能与新鲜细胞表面功能结合位点更多有关；非新鲜样本也在约60 s达到终点，但聚集体较小。结论是RBC新鲜度影响聚集体大小，而在测试条件下未明显改变操作性终点时间。

使用微流控试验检测不同HA活性水平：测试三种不同HA活性VLP制备，微流控结果与96孔板结果接近。HA-NA-M1制备产生的RBC聚集体小于gag-GFP-HA制备；使用较小液滴时聚集体大小差异变小且统计不显著。各VLP制备和液滴大小下操作性终点时间相似，最高HA活性见于新鲜制备的HA-NA-M1**储液，与96孔板结果一致。结论是该平台可区分不同HA活性水平，但在所考察条件下VLP组成未显著改变操作性成像终点时间。

微流控血凝试验的检测限：新鲜HA-NA-M1**样品在传统96孔板中血凝活性为256 HAU/50 μL。对同一VLP制备进行两倍系列稀释，传统试验阳性至第8稀释（1:256），微流控试验检测至第11稀释（1:2048），相差三个两倍稀释步骤，即所测试条件下可检测样本稀释度高8倍。作者强调该比较基于有限独立重复的稀释终点观察，应视为检测灵敏度提高的初步指示，而非统计验证的分析检测限差异，需进一步独立实验确定重现性。每个液滴约4 nL，其中约2 nL VLP样品和2 nL RBC悬液（1:1混合），显示纳升级反应体积可显著降低样本和试剂消耗。

讨论与结论部分总结：作者指出该平台可精确控制试剂包封、混合和反应时间，约60 s内提供操作性聚集体大小终点并仅消耗纳升级样本；RBC浓度、RBC:VLP比例、液滴大小和RBC新鲜度均会影响聚集体大小或操作性终点时间；平台可区分不同HA活性VLP制备，并在所测试条件下检测到高8倍样本稀释度。局限性包括未在相同微流控条件下设置HA阴性对照、非特异性RBC聚集不能完全排除、检测限比较需更多独立重复验证，以及该试验测量血凝活性而非绝对VLP颗粒浓度。结论译文：本研究展示了基于液滴的微流控平台利用VLP和RBC进行血凝活性检测与分析的能力；该装置由Y型结、T型结液滴发生器和蛇形混合通道组成，可精确控制试剂包封、混合和反应时间；与传统静态HA试验相比，在测试条件下微流控方法约60 s内提供操作性聚集体大小终点，实现更快读数且仅使用纳升级样本。系统实验表明操作性成像终点对关键试验参数敏感：RBC浓度影响聚集体大小和终点时间，稀释样本更早达到操作性终点并产生较小聚集体；增加RBC:VLP混合物中VLP比例同样使操作性终点提前并降低最终聚集体大小，与每液滴包封RBC数较少一致；在所研究液滴大小范围内操作性终点时间相似，但较大液滴因包封细胞更多而产生较大聚集体；RBC新鲜度也影响聚集体大小，新鲜样本在其它条件相同时产生较大聚集体。该装置可区分不同HA活性水平的VLP制备，并在比传统孔板试验高8倍样本稀释度下检测活性，显示提高的分析灵敏度且样本消耗极低。通过缩短试验时间、降低样本消耗和血凝活性检测限，所提出的液滴微流控平台为流感VLP制备的功能表征和疫苗生物工艺中HA活性物质监测提供了有前景的方法；重要的是，该试验测量血凝活性而非绝对VLP颗粒浓度，需独立颗粒定量建立二者之间的定量关系。