多孔海藻酸盐水凝胶中通过球体形成介导的间充质基质细胞软骨分化

《Materials Advances》：Chondrogenic differentiation of mesenchymal stromal cells in porous alginate hydrogels through spheroid formationOpen Access

　　

细胞-细胞相互作用是间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）软骨形成的重要调控因素；然而，不同类型的细胞-细胞相互作用对该过程的影响仍不明确。本研究采用氯化钙（CaCl2）溶液液滴注射法制备多孔海藻酸盐水凝胶，以控制MSCs的空间定位。通过将MSCs定位于海藻酸盐基质、微孔或两个区室中，研究人员建立了三种细胞分布模型，以控制单个MSCs之间以及球体介导的细胞-细胞相互作用。水凝胶中的MSCs在不含外源性转化生长因子-β（TGF-β）的软骨形成培养基中培养28天。研究人员评估了细胞分布、活力、球体形成、软骨形成基因表达以及软骨相关基质沉积。在相同的水凝胶系统内，海藻酸盐基质中的MSCs保持分散状态并维持高活力，但硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycan, sGAG）产生有限，软骨形成基因表达较弱。局限于微孔内的MSCs形成球体，并表现出增强的SRY-Box转录因子9（SOX9）和聚集蛋白聚糖（aggrecan）表达以及软骨相关基质沉积。仅在球体-only组中检测到II型胶原蛋白表达。综上，多孔海藻酸盐水凝胶内的MSC球体形成促进了软骨形成反应。研究结果表明，在支架中控制MSC球体形成可能是增强内源性软骨形成反应的有效策略。

一、研究背景与问题

软骨组织工程旨在通过结合细胞、生物材料和生物信号来修复受损软骨，生成功能性软骨样组织。间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）因其来源广泛且具有分化为软骨细胞的多能性而被广泛用于软骨组织工程。然而，MSCs的高效软骨分化往往依赖外源性生长因子，尤其是转化生长因子-β（TGF-β），以促进软骨相关基因表达和基质产生。但外源性生长因子策略的临床转化仍面临挑战：高剂量外源性生长因子可能诱导滑膜炎症、骨赘形成和肥大分化等不良反应。这些局限性凸显了通过激活内源性生物学程序而非依赖外源性生长因子刺激来促进MSC软骨形成的替代策略的必要性。

细胞-细胞相互作用是MSC软骨形成的重要调控因素。在胚胎肢芽形成过程中，分散的MSCs逐渐变圆并组装成致密的细胞凝聚体，这些空间组织变化使邻近细胞紧密接触并建立支持软骨形成承诺的局部微环境。然而，不同细胞-细胞相互作用模式对这一过程的影响仍不明确。既往研究中，微图案化基底虽能精确控制二维细胞接触但无法完全再现三维细胞凝聚微环境；无支架球体和微团培养虽提供三维细胞-细胞接触但缺乏周围基质分散细胞群体；生物活性支架则因引入基质衍生信号而难以单独评估细胞-细胞相互作用的贡献。因此，在相同支架配方内比较不同细胞空间排列，为考察细胞组织方式及相关细胞-细胞相互作用如何影响MSC软骨分化提供了途径。

海藻酸盐因其生物惰性和生物相容性，可通过钙介导凝胶化简便形成水凝胶，且未修饰的海藻酸盐缺乏哺乳动物细胞粘附基序，有助于排除细胞-细胞外基质（ECM）相互作用的影响。然而，传统块状海藻酸盐水凝胶通常将MSCs包封在凝胶基质中，导致细胞-细胞相互作用有限。研究人员此前开发了通过向海藻酸盐溶液注射CaCl₂溶液液滴来制备多孔海藻酸盐水凝胶的方法，液滴与周围海藻酸盐溶液界面发生离子交联形成微孔。本研究利用该平台设计三种MSC分布模型，模拟间充质凝聚的不同空间阶段，在无外源性TGF-β条件下考察细胞-细胞相互作用对MSC软骨分化的影响。

二、主要技术方法

研究人员采用CaCl₂溶液液滴注射法制备多孔海藻酸盐水凝胶。将1.2%（w/v）海藻酸盐溶液加入硅胶框架后，注入10滴（每滴0.5 μL）50 mM CaCl₂水溶液，随后浸入102 mM CaCl₂溶液完成整体凝胶化。通过改变MSCs在海藻酸盐溶液或CaCl₂溶液中的负载情况，构建三种细胞分布模型：A组仅在海藻酸盐基质中分散负载MSCs；B组在海藻酸盐基质和微孔中均负载MSCs；C组仅将MSCs局限于微孔中。各组总细胞数恒定为1.0 × 10⁶个。人骨髓来源MSCs（第4代，P4）购自Lonza公司，在无外源性TGF-β的软骨形成培养基中培养28天。研究采用活/死染色评估细胞活力，相差显微镜观察细胞分布和球体形成，ImageJ软件测量球体直径，Hoechst 33258荧光法量化DNA含量，Blyscan试剂盒检测sGAG含量，实时定量PCR分析I型胶原、II型胶原、聚集蛋白聚糖和SOX9的mRNA表达，免疫组织化学染色评估ECM蛋白沉积。

三、研究结果

（一）多孔海藻酸盐水凝胶的制备与结构表征

研究人员通过光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）确认了水凝胶内微孔结构的形成。罗丹明B标记的CaCl₂微液滴直径为772.6 ± 43.6 μm，表明液滴注射法可生成尺寸可重复的微孔。与常规乳液模板法和牺牲模板法不同，CaCl₂液滴注射法通过简单的水相凝胶化过程制备多孔海藻酸盐水凝胶，更适合直接细胞包封，且制备过程中未引入额外组分，提供了安全清洁的细胞负载平台。

（二）MSC负载多孔海藻酸盐水凝胶的制备

三种构型的多孔海藻酸盐水凝胶成功控制了细胞空间分布。培养28天期间，水凝胶整体形状保持完好，微孔区域清晰可见。A组中MSCs在海藻酸盐基质中保持分散或形成极小聚集体；B组和C组中局限于微孔内的MSCs聚集形成致密球体。定量分析显示，C组球体在14天和28天均大于B组：B组球体直径从14天的524.7 ± 13.0 μm减小至28天的485.2 ± 23.4 μm，C组从665.5 ± 25.5 μm减小至599.9 ± 42.9 μm。这些结果表明多孔海藻酸盐水凝胶系统保持了设计的细胞分布，限制细胞在基质和微孔间的迁移，同时支持微孔内MSC球体形成。

（三）多孔海藻酸盐水凝胶中的细胞活力

活/死染色显示，各组MSCs在水凝胶制备后立即保持高活力，表明Ca²⁺介导的离子交联对MSC活力影响甚微。培养过程中细胞活力受空间分布影响：A组分散于基质中的MSCs在28天内维持高活力；B组基质中分散细胞大多保持活力，但球体内出现部分细胞死亡；C组仅局限于微孔的MSCs在14天和28天均观察到球体内死细胞。球体内的部分细胞死亡可能归因于致密细胞聚集体中营养物质和氧气扩散受限。

（四）MSC负载多孔海藻酸盐水凝胶中的细胞增殖与sGAG产生

DNA定量分析显示，A组DNA量从第0天至第28天无显著变化，表明基质中分散的MSCs维持相对稳定的细胞数量；B组和C组DNA量随时间下降，其中C组下降最为显著，28天时在三组中最低。各组间比较显示，A组在14天和28天均维持最高DNA量，依次为B组和C组。sGAG检测显示第0天各组均未检测到sGAG，表明初始接种的MSCs未产生软骨基质。14至28天期间，B组sGAG含量增加而C组减少，A组无显著变化；C组在两个时间点的sGAG含量均显著高于A组和B组。sGAG/DNA比值在各组均随时间增加，C组最高，依次为B组和A组，组间差异显著。结果表明球体介导的细胞-细胞相互作用强烈促进软骨基质产生。

（五）软骨形成基因表达的定量分析

实时定量PCR分析显示各组MSCs呈现不同基因表达模式。I型胶原mRNA表达在A组相对较低，B组和C组在14天和28天均较高，C组最高。II型胶原mRNA在P4 MSCs和各组第14天均未检测到，仅在28天的C组中检测到。聚集蛋白聚糖mRNA表达呈A组 < B组 < C组的递增模式。SOX9表达在A组两个时间点均未检测到，在B组和C组中检测到，C组高于B组，28天时差异显著。A组中分散于海藻酸盐基质的MSCs因直接细胞-细胞接触有限，I型胶原和聚集蛋白聚糖表达较P4 MSCs下降，SOX9和II型胶原未检测到，表明在无TGF-β条件下，单纯生物惰性海藻酸盐基质的三维培养不足以诱导软骨分化。B组中聚集蛋白聚糖和SOX9表达增加表明分散细胞与球体共存一定程度促进软骨分化，但II型胶原仍未检测到，提示分化程度尚不足以诱导该软骨特异性标志物。C组中所有MSCs局限于微孔形成致密球体，提供最强的球体介导细胞-细胞相互作用，28天时聚集蛋白聚糖、SOX9和II型胶原表达均为最高。

（六）软骨基质的免疫组织化学染色

培养28天后的免疫组织化学染色显示，A组I型胶原和聚集蛋白聚糖染色较弱，II型胶原几乎不可见，表明个体细胞-细胞相互作用导致ECM产生有限。B组中I型胶原和聚集蛋白聚糖在球体内呈强染色，周围分散细胞染色较弱，II型胶原几乎不可检测。C组球体聚集蛋白聚糖和II型胶原呈强染色，I型胶原染色弱于B组球体。这些结果表明球体形成促进了MSC的ECM沉积，但沉积基质的组成和数量取决于细胞-细胞相互作用类型：B组球体虽较小但I型胶原染色更强，可能仍处于富含I型胶原的基质形成阶段；C组球体聚集蛋白聚糖和II型胶原染色更强，表明向更软骨相关基质表型进展。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究利用多孔海藻酸盐水凝胶平台，在无外源性TGF-β条件下考察细胞-细胞相互作用对MSC软骨分化的影响。未修饰海藻酸盐缺乏细胞粘附配体，减少整合素介导的细胞-基质粘附，使细胞-细胞相互作用的作用得以单独评估。离子交联海藻酸盐水凝胶的粘弹性特征（损耗角正切约0.19，半松弛时间4.68 ± 0.50 s）为MSC三维培养提供了适宜的粘弹性微环境。然而，即便在有利的粘弹性环境中，无外源性TGF-β刺激的A组MSCs仍表现出有限的sGAG产生和较弱的软骨形成基因表达，归因于缺乏外源性TGF-β刺激或细胞-细胞相互作用。微孔内球体形成可能与钙粘蛋白/连环蛋白介导的细胞-细胞粘附有关，可稳定致密细胞聚集体。各组间软骨分化水平的差异最可能归因于不同的细胞-细胞相互作用：A组分散细胞直接接触有限，加之未修饰海藻酸盐限制整合素介导的粘附，导致软骨相关基因和ECM组分低表达；C组球体内细胞直接接触形成强细胞-细胞相互作用，有效促进软骨分化；B组球体介导的强相互作用与分散细胞弱相互作用共存，产生中等水平软骨形成。研究未使用外源性TGF-β，B组和C组虽表现出软骨分化特征但分化不完全，软骨分化已启动但需进一步诱导才能完成。

研究结论：研究人员采用CaCl₂溶液液滴注射法制备了MSC负载多孔海藻酸盐水凝胶，在生物惰性三维环境中控制MSCs的细胞-细胞相互作用。通过将MSCs定位于水凝胶基质、微孔或两个区室，该平台调节了间充质凝聚的空间特征，实现了不同细胞-细胞相互作用模式的比较。局限于微孔内的MSCs形成球体，表现出增强的软骨形成基因表达和软骨相关基质沉积，表明即使在无外源性TGF-β刺激条件下，球体介导的细胞-细胞相互作用也能促进MSC软骨形成。这些发现提示，在多孔水凝胶中控制MSC球体形成可能是增强内源性软骨形成反应的有效策略。