泰国发酵牛肉香肠源植物乳植杆菌MUM8-1A的多组学特征：益生性状与安全性评价

《Journal of Agriculture and Food Research》：Multi-Omics Characterization of Lactiplantibacillus plantarum MUM8-1A from Thai Fermented Beef Sausage: Probiotic Traits and Safety

　　

整合表型、基因组与代谢组分析表明，源自传统泰国发酵牛肉香肠的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）MUM8-1A是具前景的益生菌候选菌株。菌株MUM8-1A表现出强胃肠道耐受性、优于对照的Caco-2（人结肠腺癌细胞系）黏附、阳性胆汁盐水解酶（BSH）活性及高体外胆固醇同化能力。该菌株表现出强抗氧化活性，并显著减弱脂多糖（LPS）诱导的THP-1（人单核细胞系）来源巨噬细胞样细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）产生。全基因组分析确认良好安全性特征：未检出获得性抗菌药物耐药基因、主要毒力决定因子或完整生物胺生物合成途径。非靶向液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）代谢组学揭示广泛胞外代谢重塑，涉及γ-氨基丁酸（GABA）相关、氨基酸、维生素/辅因子、核苷酸、脂质及氧化还原相关代谢，支持MUM8-1A的益生功能。

研究背景与问题：传统发酵食品是乳酸菌（LAB）的重要生态位，发酵过程中的酸化、营养限制、盐胁迫、微生物竞争及底物来源生物活性物质形成选择压力。植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）以生态适应性、碳水化合物利用、胁迫耐受及益生相关代谢能力著称，但相关功能具有显著菌株特异性。泰国传统发酵肉制品naem、sai krok isan和mum wua等可富集适应肉品基质的LAB；其中naem与sai krok isan已有部分益生相关或生物活性研究，而mum wua的研究多集中于发酵过程中LAB种群动态和物种组成，菌株水平的功能、基因组安全及代谢特征仍有限。益生功能不能仅在种水平外推，候选菌株需结合准确分类、体外益生相关表型、全基因组安全评估和代谢背景综合判断。尤其植物乳植杆菌群（L. plantarum group）内16S rRNA基因序列高度保守，常规16S rRNA基因鉴定不足以可靠区分近缘种，需采用平均核苷酸一致性（ANI，基因组物种界定指标）、数字DNA–DNA杂交（dDDH）和系统发育基因组学。基于此，研究人员以mum wua来源菌株MUM8-1A为对象，开展整合表型、基因组和非靶向代谢组研究，以评估其益生相关功能、安全性和胞外代谢重塑，为菌株水平候选筛选提供依据；作者同时强调体外益生相关表型不等同于已证实的宿主健康益处。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员从8份mum wua（泰国传统发酵牛肉香肠）样本分离45株推定LAB，并因MUM8-1A胆固醇同化较高而选其深入分析；菌株来源样本于2020年5月11日购自泰国孔敬府Mueang Khon Kaen县Ton Tann Market。表型分析包括模拟胃肠转运、Caco-2黏附、溶血、肉汤微量稀释药敏、BSH、胆固醇同化、THP-1来源巨噬细胞免疫调节及DPPH/ABTS自由基清除。基因组采用Nanopore与Illumina混合测序，结合PGAP/RAST注释、ANI/dDDH/系统发育、ResFinder/CARD/PathogenFinder/PlasmidFinder/MOB-suite/PHASTEST、dbCAN、antiSMASH和BAGEL4分析。代谢组采用非靶向UPLC–MS/MS，设3个独立生物学重复及无菌MRS对照，以Compound Discoverer和MetaboAnalyst 6.0处理。

主要结果：
3.1 Isolation, phenotypic characterization, and genome-based identification of strain MUM8-1A（分离、表型表征与基因组鉴定）：通过分离培养和表型试验，发现MUM8-1A为革兰阳性、杆状、触酶阴性，可耐6%和8% NaCl、pH 3和9及15°C和45°C，并具广谱碳水化合物发酵特征；16S rRNA基因与近缘种高度相似，进一步经ANI、dDDH和系统发育分析将其鉴定为Lactiplantibacillus plantarum。
3.2 Whole-genome features and putative genome defense-related elements of strain MUM8-1A（全基因组特征与假定基因组防御元件）：全基因组测序和注释显示基因组3,286,841 bp、G+C 44.4%、N50 1,739,192 bp、CheckM完整性99.02%、污染1.82%，含3,177个编码序列和79个RNA基因；CRISPRCasFinder发现两个证据等级2的CRISPR阵列但无清晰cas基因，作者谨慎解释为可能残留或既往外源遗传元件暴露迹象。
3.3 Gastrointestinal transit tolerance of strain MUM8-1A（胃肠转运耐受）：通过模拟胃和小肠序贯暴露，发现胃阶段3 h后菌数由9.12±0.18降至8.48±0.22 log CFU/mL，肠阶段5 h后仍达6.82±0.25 log CFU/mL，高于LGG的5.94±0.23 log CFU/mL，结合应激、酸/胆适应和质子稳态相关基因，表明其体外胃肠耐受较强。
3.4 Adhesion ability of strain MUM8-1A to Caco-2 intestinal epithelial cells（Caco-2黏附）：通过Caco-2细胞黏附试验，发现MUM8-1A黏附率76.84±1.28%，显著高于LGG的68.42±1.15%，基因组中鉴定出表面蛋白、LPXTG基序蛋白、分选酶依赖蛋白、黏液结合蛋白、延伸因子Tu和GroEL等黏附相关基因，支持其高体外上皮黏附潜力。
3.5 Antibiotic susceptibility（抗生素敏感性）：通过肉汤微量稀释和EFSA微生物学截断值判读，发现MUM8-1A对氯霉素、克林霉素、庆大霉素、卡那霉素和四环素敏感，对氨苄西林（MIC 4 mg/L）和红霉素（MIC 2 mg/L）表型耐药；ResFinder未检出获得性耐药基因，CARD无perfect命中、1个strict命中vanY，作者将其解释为表型–基因型不一致而非明确内在耐药机制。
3.6 Cholesterol-lowering potential and bile salt hydrolase activity of strain MUM8-1A（降胆固醇潜力与BSH活性）：通过TDCA含钙平板和胆固醇同化试验，发现MUM8-1A呈BSH阳性并携带bsh基因，24 h去除89.55±5.23%胆固醇；作者认为其降胆固醇相关潜力可能涉及BSH、表面结合、膜掺入等多机制。
3.7 Immunomodulatory activity of strain MUM8-1A in THP-1-derived macrophage-like cells（THP-1来源巨噬细胞样细胞免疫调节）：通过PMA分化THP-1细胞、LPS刺激及ELISA检测，发现MUM8-1A细胞游离上清（CFS）和热灭活细胞均显著降低LPS诱导的TNF-α产生，IL-6多处低于定量限而仅作定性；代谢组中吲哚和吲哚-3-乳酸仅为推定注释，作者将其作为假设生成性背景而非因果证据。
3.8 DPPH and ABTS radical scavenging activities（DPPH与ABTS自由基清除）：通过DPPH和ABTS试验，发现MUM8-1A CFS的DPPH清除率99.50±1.50%、ABTS清除率87.53±0.72%，显示明显体外自由基清除活性；DPPH试验缺少匹配无菌MRS对照，作者结合ABTS及GABA、焦谷氨酸等推定代谢特征谨慎解释。
3.9 Probiogenomic traits of strain MUM8-1A（益生基因组特征）：通过基因组注释，发现其携带酸应激、胆盐适应、膜保护、质子调控、黏附与细胞表面、碳水化合物利用及转录调控相关基因，包括F₁F₀-ATPase相关组分、luxS、LPXTG基序蛋白、分选酶依赖蛋白、黏液结合蛋白、GroEL和延伸因子Tu等，为表型提供互补基因组背景。
3.10 Whole-genome-based safety assessment of strain MUM8-1A（全基因组安全评估）：通过PathogenFinder、毒力基因、AMR、移动遗传元件、溶血、抗菌药生物合成、生物胺和D-乳酸相关分析，发现MUM8-1A预测为非人病原，无主要毒力决定因子，hlyIII存在但无溶血表型，无获得性AMR基因和完整生物胺或临床重要抗菌药生物合成途径；预测到2个质粒样序列（一个可移动、一个不可移动）和3个前噬菌体区（2完整、1不完整），但未连接获得性AMR、主要毒力或毒素基因；D-乳酸相关基因存在但未定量，作者解释为代谢潜力而非过量产生证据。
3.11 Carbohydrate-active enzyme analysis（碳水化合物活性酶分析）：通过dbCAN的HMMER和DIAMOND策略，发现HMMER识别98个推定CAZyme基因（GH 51、GT 39、CE 5、CBM 3、AA 3），DIAMOND识别224个，作者认为HMMER支持及共识预测更可靠；GH和GT占优提示较强碳水化合物降解、修饰及含碳水细胞结构合成潜力。
3.12 Untargeted metabolomic profiling and metabolite set enrichment analysis of strain MUM8-1A（非靶向代谢组与代谢物集富集）：通过正负离子模式LC–MS/MS比较无菌MRS与MUM8-1A发酵MRS，发现大量胞外代谢特征重塑，正离子数据36,431个特征中23,113个至少在一种条件检出，负离子7,371个中5,733个至少一种条件检出；推定注释涉及GABA相关、氨基酸、维生素/辅因子、核苷酸周转、色氨酸/吲哚、氧化还原、有机酸/中心碳和脂质代谢，GABA峰面积较高，焦谷氨酸、吲哚和吲哚-3-乳酸等仅见于或富集于发酵 broth；MetaboAnalyst 6.0富集到氨基酸、谷胱甘肽、维生素/辅因子、糖酵解/糖异生、脂质和丙酸代谢等集合，但作者强调代谢物为推定注释、峰面积为相对信号，不能作绝对定量或因果解释。

讨论总结与结论翻译：讨论部分强调，MUM8-1A的胃肠耐受、黏附、BSH、胆固醇同化、免疫调节和抗氧化结果均为受控体外条件下的益生相关表型，不能等同于宿主健康效应；基因组安全评估主要为预测性，代谢组注释为推定且未用真实标准品确认，基因–代谢物–表型联系为生物学上合理的关联而非已验证因果。因此，后续需靶向定量、功能验证及体内或临床证据。结论翻译：研究人员采用整合表型、基因组和代谢组方法，将分离自泰国传统发酵牛肉香肠mum wua的Lactiplantibacillus plantarum MUM8-1A鉴定为有前景的益生菌候选。基于ANI、dDDH和系统发育基因组学的分类确认了其物种身份；表型试验显示其具稳健胃肠耐受（序贯模拟胃和小肠暴露后活菌数仍高于6 log CFU/mL），Caco-2黏附高于参考益生菌Lacticaseibacillus rhamnosus GG。功能上，MUM8-1A呈阳性BSH活性、高胆固醇同化能力、体外免疫调节活性（主要降低LPS诱导TNF-α并呈较低IL-6响应）及较强DPPH和ABTS自由基清除活性。结合表型溶血和药敏试验的基因组安全评估在评价条件下未发现主要安全 concern；未检出获得性抗菌药物耐药基因、主要毒力决定因子、可检测溶血活性、完整生物胺生物合成途径或完整抗菌药生物合成途径及相关生物合成基因簇。CAZyme分析提示广谱碳水化合物代谢能力，非靶向代谢组揭示与GABA相关代谢、氨基酸代谢、维生素和辅因子代谢、核苷酸周转、脂质相关代谢及氧化还原相关通路有关的胞外代谢重塑。总体而言，这些发现突出MUM8-1A为来自泰国传统发酵食品的代谢多能且功能上有前景的益生菌候选，为未来功能食品和益生菌应用提供了有价值的基础。