基于生物活性导向分离的甘草属抗炎酚类成分及二异戊烯基异黄酮作为NF-κB/p65核转位抑制剂研究

《Journal of Agriculture and Food Research》：Bioassay-guided isolation of anti-inflammatory phenolic constituents from Glycyrrhiza species

　　

本研究对药典收载的G. glabra L.与G. uralensis Fisch.，以及研究较少的G. foetida Desf.、G. echinata Lepech.、G. pallidiflora Maxim.、G. yunnanensis S. H. Cheng & L. K. Tai ex P. C. Li的体外抗炎活性进行比较分析。研究人员采用携带报告基因（SEAP）的人单核细胞样细胞（THP-1）模型，监测不同条件下NF-κB信号通路表达；脂多糖（LPS）通过THP-1细胞所表达的Toll样受体4（TLR4）触发炎症反应，该反应包括NF-κB向细胞核转位。通过抗体标记NF-κB亚基p65，可监测天然化合物的作用。因此，本研究主要目标为比较甘草属物种，采用生物活性导向分离获得具有抗炎活性的化合物，并评价其对LPS诱导p65核转位的抑制作用。

甘草属（Glycyrrhiza）为豆科植物，全球已有39种被接受，药典主要收载G. glabra L.、G. uralensis Fisch. ex DC.和G. inflata Bat.，其地下部分传统用于祛痰及抗炎，含三萜皂苷和异戊烯基酚类等次生代谢物。现有问题在于工业提取甘草酸过程中大量活性次生代谢物未充分利用，药典外物种研究不足，且酚类因膜通透性有限而影响活性；C-异戊烯基化被认为可增强膜通透性并保留氢键能力，进而影响NF-κB（nuclear factor kappa-B，核因子κB）激活及促炎细胞因子产生。基于此，研究人员比较六种甘草属植物体外抗炎活性，并以生物活性导向分离抗炎酚类成分，评价其对LPS诱导p65核转位的抑制作用，以寻找抗炎先导化合物并为标准化提取物提供依据。

关键技术方法概述（约250字内）：研究人员取六种甘草地下部分，乙醇提取后依次用正己烷、CHCl₃和EtOAc分配，以HPLC-DAD进行定性分析；采用THP1-Blue?报告细胞、WST-1细胞活力实验和QUANTI-Blue?实验评价NF-κB抑制，随后以RP-C₁₈ flash色谱和RP-Amide半制备HPLC进行生物活性导向分离，结合NMR、HRMS和ECD鉴定结构；以免疫细胞化学结合CellProfiler定量p65核/胞质荧光比，采用Kruskal–Wallis检验及Dunn事后检验。样本来源：G. glabra、G. uralensis、G. echinata、G. foetida和G. pallidiflora由MENDELU Faculty of Horticulture in Lednice, Czech Republic提供，由Assoc. Prof. Jarmila Neugebauerová鉴定；G. yunnanensis由Botanical Garden of the City of Prague提供，由Jarmila Skru?ná MSc.鉴定；用于分离的G. uralensis于2024年9月采自Lednice，凭证标本42A4400023。

研究结果：3.1 化学分类学差异（Chemotaxonomic differences）：HPLC-DAD显示六种甘草分配提取物产量及图谱存在化学分类学差异，不同植物登录号间未见定性差异；因未进行总定量，每一登录号仅测试一个物种的分配组分；G. glabra与G. uralensis的脂溶性酚类含量较高。3.2 分配提取物对NF-κB活性的影响（Effects of partitioned extracts from Glycyrrhiza species extracts on activity of NF-κB）：CHCl₃可溶提取物显著抑制NF-κB信号通路，EtOAc可溶提取物（3 μg/mL）多无活性；G. uralensis的CHCl₃可溶提取物（3 μg/mL）作用最突出，使NF-κB表达抑制至20%以下，故被选为分离抗炎化合物的候选。3.3 G. uralensis CHCl₃可溶提取物色谱组分对NF-κB活性的影响（Effects of chromatographic fractions from G. uralensis CHCl₃-soluble extract on activity of NF-κB）：RP-C₁₈ flash色谱得到GUC1–15，0.5 μg/mL下活性差异明显，GUC10–14抑制最显著（p<0.0001），被选用于分离。3.4 G. uralensis化合物的分离与鉴定（Isolation and identification of compounds from G. uralensis）：经C₁₈与RP-Amide生物活性导向分离获得9个纯度>95%的化合物，包括3个异戊烯基异黄烷酮（1、3、6）和6个异戊烯基异黄酮（2、4、5、7–9）；结构由NMR、HRMS及文献比对鉴定，6和8的B环构型依据acetone-d₆中5-OH质子化学位移确定；异黄烷酮绝对构型未确定，因ECD无Cotton效应提示外消旋。3.5 化合物对NF-κB活性的影响（Effects of compounds isolated from G. uralensis on activity of NF-κB）：1 μM下除gancaonin H（2）外均有显著抑制作用；isochandalone（9）显著抑制（p<0.01），其余作用更显著（p<0.0001）；化合物1和8最活跃，使NF-κB下调至50%以下。3.6 化合物对p65核转位的影响（Effects of compounds isolated from G. uralensis on nuclear translocation of p65）：依据稳定性和NF-κB抑制结果选择1、4、5、8，以1 μM免疫细胞化学检测；3和7因化学不稳定被排除；化合物5作用最明显；所有测试化合物均显著抑制p65核转位（p<0.0001，与DMSO对照比较），以核/胞质比定量。

讨论部分总结：原文认为种间抗炎活性差异与化学轮廓特别是CHCl₃可溶部分脂溶性酚类相关；部分色谱组分作用强于纯化合物，提示成分互作或未鉴定/微量成分可能贡献，但现有证据不足以确立真正协同作用。构效关系方面，CHCl₃部分富含异戊烯基酚类，支持其脂溶性增强膜相互作用的假说；EtOAc部分富含黄酮糖苷和高极性酚类，在测试浓度下活性低；分离物均为二异戊烯基异黄酮，提示异戊烯基化程度增强活性，B环游离羟基增多可能与抑制活性增强相关。p65定位研究建立了微孔板规模的高内涵定量方法，结果与类似异戊烯基酚类文献一致；原文提示化合物可能作用于上游信号，最可能涉及IKK复合物抑制，但不能区分对IKK本身、上游激活因子或IκBα磷酸化的抑制，需直接生化实验验证。稳定性方面，异黄酮稳定，异黄烷酮在DMSO中可降解并易消旋，故异戊烯基异黄酮更适合进一步开发。局限包括仅使用一种细胞系进行体外实验、机制未明、纯化合物仅测试单一浓度而无法确定剂量依赖性和IC₅₀、化合物在实验中的稳定性未系统评价、提取物化学谱仅为定性分析且未用分析标准品确证全部化合物。

研究结论翻译：本研究对甘草属物种的抗炎作用进行了有价值的比较分析，指出G. uralensis是分离抗炎化合物或制备具有潜在药理应用标准化提取物的有前景候选。本研究进一步展示独特的分离技术，与生物测定结合时，构成选择性分离生物活性成分的有效方法，并可应用于多种药用植物。此外，本研究展示了通过免疫细胞化学定量p65细胞定位的高效高通量方法。本研究还强调二异戊烯基异黄酮作为NF-κB抑制剂的巨大潜力，为进一步研究其详细抗炎活性及可能发现新的合成路线打开了大门。