熔体电写与三维生物打印混合构建层级化骨膜仿生体外平台

《Advanced Healthcare Materials》：Hybrid Biofabrication of a Hierarchically Organized Periosteum-Inspired In Vitro Platform

　　

骨膜是一种层级化组织、血管化的膜结构，对骨骼维持和再生至关重要，然而能够再现其区室化和多细胞架构的体外模型仍然有限。在本研究中，研究人员通过整合熔体电写（melt electrowriting, MEW）与挤出式三维（3D）生物打印，构建了一种层级化组织、骨膜仿生的体外平台。该平台整合了负载人成骨细胞（human osteoblast）的血浆海藻酸盐/甲基纤维素水凝胶区室、可配置的MEW-聚己内酯（PCL）微纤维界面，以及负载内皮细胞-成纤维细胞的纤维蛋白/明胶水凝胶区室。研究人员根据候选MEW支架架构和区室特异性生物墨水-细胞配置支持成骨成熟相关读数和CD31⁺内皮细胞组织化的能力，对其进行了筛选。所得三层结构在长达49天的培养中保持了高细胞相容性和结构完整性。成骨区室支持成骨分化相关读数和矿化基质沉积，而含内皮细胞区室则支持相互连接的CD31⁺内皮细胞组织化，并伴有内皮细胞相关基因表达。总体而言，这种混合MEW-3D生物打印平台提供了一种可工程化的体外模型，用于骨膜仿生组织建模、生物材料筛选，以及在受控条件下研究成骨和内皮细胞相关过程。

骨膜是一种高度特化的血管化结缔组织膜，覆盖于大多数骨表面，在骨骼生长、稳态维持和再生中发挥关键作用。然而，现有体外模型难以同时再现骨膜固有的区室化多细胞架构，主要挑战包括：稳定整合力学和生物学性质不同的层结构；在缺乏原生血管床和生理灌注的条件下维持内皮细胞组织化；以及在长期培养中同步支持区室特异性的成骨和内皮细胞相关过程。已有的人工骨膜策略多集中于成骨功能，或依赖电纺丝等难以精确编程微结构的方法，缺乏独立可调的纤维界面和双谱系支持能力。为此，研究人员提出将熔体电写（MEW）的高分辨率微纤维构建能力与挤出式三维（3D）生物打印的多材料细胞负载能力相结合，开发一种层级化、骨膜仿生的三层体外平台。

该研究构建了由成骨区室（负载人成骨细胞hOB的血浆海藻酸/甲基纤维素水凝胶）、可配置MEW-PCL微纤维界面以及内皮细胞区室（负载人脐静脉内皮细胞HUVEC和正常人真皮成纤维细胞NHDF的纤维蛋白/明胶水凝胶）组成的三层结构。通过模块级筛选确定最优的支架架构和生物墨水-细胞配置，随后组装为完整构建体并长期培养至49天。研究发现，该平台在维持高细胞相容性和结构完整性的同时，支持成骨区室的成熟相关生化指标与矿化沉积，以及内皮细胞区室中相互连接的CD31⁺内皮细胞组织和相关基因表达。该工作发表于《Advanced Healthcare Materials》，为骨膜仿生组织建模、生物材料筛选和成骨-内皮耦合机制研究提供了可工程化的体外实验平台。

关键技术方法方面，研究人员主要采用了三类技术：一是熔体电写（MEW）制备聚己内酯（PCL）微纤维支架，通过控制沉积路径产生单向或双向有序纤维网络；二是基于多通道挤出的3D生物打印，分别打印含成骨细胞或内皮细胞/成纤维细胞的复合水凝胶墨水；三是模块化组装策略，将预制纤维支架与打印水凝胶层序贯整合，再经交联形成一体化三层结构。样本来源包括：hOB自一名65岁男性骨关节炎患者的股骨头分离获得；HUVEC和NHDF购自PromoCell；人骨髓间充质基质细胞（hBMSC）由Prof. Bornh?user惠赠。此外，还运用了力学测试、活/死染色、免疫荧光、骨钙素染色、实时定量PCR及光学相干断层扫描（OCT）等手段进行评价。

研究结果部分保留了原文中的小标题并概括如下：

3.1 MEW-3D生物打印构建骨膜仿生多区室平台：通过概念设计和混合制造流程，将成骨区室（Ost）、纤维界面（F）和内皮细胞区室（Vas）整合为三层结构，验证了该策略的可行性。

3.2 基于MEW的骨膜仿生微纤维界面工程：比较了单向（Uni）和双向（Bi）两种30°菱形网格PCL支架，两者均支持hBMSC和NHDF存活超过21天；双向支架降低了力学各向异性，使细胞产生多向伸展和相互连接的组织形态，因此被选为后续构建体的纤维界面。

3.3 MEW整合的成骨区室工程（Ost-F模块）：在两种生物墨水筛选中，血浆海藻酸/甲基纤维素（Alg/MC-plasma）比海藻酸/明胶（Alg/Gel）表现出更均匀的细胞分布和更连续的界面桥接；在35天成骨培养中，Ost-F模块显示出DNA和乳酸脱氢酶（LDH）活性升高、碱性磷酸酶（ALP）活性上升、成骨基因（BMP2、RUNX2、ALPL、IBSP、BGLAP）时序性上调，以及沿MEW纤维分布的钙结节沉积，证明该模块支持成骨成熟和结构引导的基质矿化。

3.4 MEW整合的内皮细胞区室工程（Vas-F模块）：比较了Alg/MC-plasma中HUVEC单培养或HUVEC/hOB共培养以及Fib/Gel中HUVEC/NHDF共培养，发现仅Fib/Gel配置可形成随时间增加的相互连接的CD31⁺结构；在28天培养中，Vas-F模块显示出分支点数、CD31⁺面积分数和骨架总长度的动态变化，以及内皮相关基因（vWF、CD31、VEGFR2、VEGFA、CDH5）的表达上调，表明该模块支持内皮细胞组织化。

3.5 整合Ost-F-Vas平台的组装与长期评估：通过OCT成像确认第49天时三层结构仍可辨识，水凝胶区室与中央MEW界面保持相对位置，未发生大面积分层。活/死染色显示两个区室在培养至49天期间均保持活性细胞，DNA含量随时间增长。与缺少成骨细胞或内皮细胞的对照相比，完全细胞化构建体表现出更持续的ALP活性和成骨基因表达，以及沿纤维分布的渐进性矿化沉积；CD31⁺内皮结构在对照中于第14天即达峰值后下降，而在完全细胞化构建体中延迟出现但持续存在至第49天，提示两个区室之间存在时间动态的相互作用。

讨论部分指出，该平台的核心价值在于模块化区室设计和可控的纤维界面，使不同细胞类型在共享培养基条件下可被并行评估；MEW双向纤维结构减少了力学方向依赖，并为细胞提供接触引导；区室特异性生物墨水筛选策略优于追求单一“通用”墨水；培养基平衡（如地塞米松浓度、VEGF组合）是影响成骨和内皮共发育的重要因素。研究结论翻译为：总之，本研究通过混合生物制造策略成功建立了一个层级化、骨膜仿生的三层体外平台，该平台整合了可调微纤维界面与空间分隔的成骨及内皮细胞水凝胶区室。在模块筛选后，整合构建体培养至第49天仍保持可区分的层状结构和主要细胞活力，并支持持续的成骨成熟相关生化读数、进行性矿化相关钙沉积，以及可检测的CD31⁺内皮细胞组织化。该平台为骨膜仿生组织建模和可控条件下的多细胞过程研究提供了可工程化的人细胞多区室工具。