基于UHF-US三维重建的CAM活体PDAC肿瘤模型高分辨率无创体积成像研究

《International Journal of Biomedical Imaging》：High-Resolution Imaging via UHF-US–Based 3D Reconstruction in a 3D In Vivo Tumor Model

　　

绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）模型类似于一种用于移植不同肿瘤的临床前体内平台，尤其适合新型癌症疗法的开发与评价。由于CAM具有广泛的血管网络，其可维持移植的人肿瘤组织，并可在整个实验过程中用于治疗测试和分析。尽管众多研究已证明肿瘤成功移植并血管整合入CAM血管网络，肿瘤体积的准确且序贯测量仍是一项重大挑战。当前成像方式，如正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（positron emission tomography/computed tomography，PET/CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）或三维（three-dimensional，3D）数字显微镜，受成本、复杂性以及注射剂或辐射所致潜在危害的限制。本研究引入一种创新成像方法，利用超高频（ultrahigh frequency，UHF）超声并结合CAM上胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）的3D超声重建。通过利用高达71 MHz的超声频率，PDAC肿瘤的二维（two-dimensional，2D）成像被转化为全面的3D重建。这一创新方法提供更详细的组织分辨率，并实现体内肿瘤生长的非侵入性纵向体积监测，原则上为未来评估血管生成（angiogenesis）和治疗反应（therapy response）的研究提供平台。本研究中，研究人员通过将3D UHF超声与既有成像技术如3D数字显微镜进行比较，检验了3D UHF超声的准确性。总之，三维超声重建类似于一种更通用的非侵入性替代方案，用于体内肿瘤体积测量。这一先进成像方法通过提供移植肿瘤组织的非侵入性体积和形态学表征，为CAM模型中肿瘤生物学研究增加了有价值的方法学，从而连接临床前研究与临床应用。

研究背景与意义：CAM（绒毛尿囊膜，chorioallantoic membrane）模型是一种成本较低、用途较广的临床前体内平台，可用于肿瘤移植及新型癌症疗法开发与评价；其致密血管网络可为移植的人肿瘤组织提供营养和氧，且免疫系统发育不全，因而可维持组织活性并支持治疗测试。尽管已有研究证明肿瘤可在CAM上成功移植并与血管网络整合，但在治疗应用和测试过程中，肿瘤体积的可重复、实验内体内测量仍是难题。现有成像方法如PET/CT（正电子发射断层扫描/计算机断层扫描）、MRI（磁共振成像）和3D数字显微镜常受成本、复杂性、辐射或注射对比剂潜在危害限制。该研究旨在开发一种基于UHF-US（超高频超声）的3D成像方式，用于CAM模型上PDAC（胰腺导管腺癌，pancreatic ductal adenocarcinoma）分析，并以3D数字显微镜等传统方法验证；其意义在于提供非侵入、快速、高分辨的体内纵向体积和形态学监测，连接临床前研究与临床应用，并符合3R原则。

关键技术方法（≤250字）：PDAC组织取自雷根斯堡大学医院（University Hospital Regensburg）外科接受手术切除、书面知情同意且获伦理批准（20-1989-101）的患者；受精鸡蛋来自认证供应商并建立CAM模型。采用71 MHz Vevo MD行2D UHF-US，并以PIUR Infinity手持3D运动传感器和平台进行自由手扫描及3D重建；Tomographic Ultrasound软件分割，Blender v.4.2.0基于闭合网格计算体积；以Keyence VHX-7000 3D数字显微镜和临床CT作比较，使用50、100、200 mm³定体积体模验证，统计用GraphPad Prism 9.2.0与R。

研究结果：
3.1 CAM模型中的组织移植：研究人员将PDAC患者手术切除当日获得的新鲜组织移植至CAM，7天后组织学分析显示移植组织有活力，PDAC肿瘤周围血管分支增强，呈实性或分散生长，大型多形性PDAC细胞围绕大小不等的空腔；说明该模型可维持患者来源PDAC组织。
3.2 UHF-US：通过在CAM局部应用1 mL NaCl增强声耦合，将换能器轻置于CAM并调整压力使组织聚焦，以连续稳定扫查和保持一致平行手位获得高质量视频；成功扫描可转换为3D，胚胎运动或操作不稳可致边缘畸变和扫描质量下降，多次录像可提高结果质量。
3.3 软件三维重建：通过PIUR IMAGING Infinity录制视频转帧及分析软件，将单向线性扫查获得的密集2D图像自动重建为3D数据集，并可在横断、矢状和冠状面多平面观察与定量；注释需在三平面复核，分割后可导出STL/OBJ至Blender，以1×1×1 cm参考立方体校准并进行闭合网格体积计算。用50、100、200 mm³体模比较3D UHF-US与3D数字显微镜（每组n=4–5，每样本重复测量），探索性Wilcoxon符号秩检验各体积均无显著差异；50 mm³组数字显微镜中位≈37 mm³，UHF-US中位≈50 mm³；Bland–Altman偏倚分别为数字显微镜?0.56、UHF-US 2.16，LoA分别为?32.20～31.08与?9.94～14.27；说明3D US体积准确度至少与3D数字显微镜等效，在小体积更具优势。多次UHF-US测量可纵向捕捉同一肿瘤形态和结构随时间的变化。
3.4 UHF-US扫描设置与技术：由于蛋壳窗口空间受限且CAM移动可使肿瘤移位，需最大化窗口以利换能器移动而不损伤CAM；保持换能器与CAM表面及肿瘤间恒定距离、稳定运动、标准化90°扫描角度并单向线性扫查，系统记录x、y、z坐标和探头总行程，无需手动角度调整，从而减少重建误差。
3.5 三维注释的考虑：软件可能误识别肿瘤边界，需在矢状、冠状和横断三平面逐帧复核并添加标记校正，完整三平面注释可提高3D重建准确性和可重复性。
3.6 CT与数字显微镜三维重建的比较：对10个肾囊肿样本，CT与3D数字显微镜体积比较的探索性双尾Wilcoxon配对符号秩检验p>0.05，无显著差异；配对样本变异小，离体数字显微镜与观察期初体内CT强一致，未见系统偏倚，支持二者体积分析可互换。代表性PDAC离体3D数字显微镜可显示表面不规则和高度分布，匹配样本CT与数字显微镜体积差异小（如96 vs 94.79 mm³、85 vs 78.58 mm³），支持光学3D重建准确性。

讨论部分总结：讨论指出，CAM模型可作为鼠类模型的替代，随着患者来源组织和纵向治疗研究增加，可靠的肿瘤生长、形态及治疗反应定量方法十分重要。反射光数字显微镜为无标记、表面重建技术，适合离体表面体积分析，但不能显示囊性/坏死等内部特征，且需终末切除，不适用于CAM纵向体内监测；MRI成本高且常需对比剂或麻醉，OCT扫描深度有限，micro-CT常需固定胚胎。3D UHF-US的优势在于非侵入、快速（每个CAM模型通常5–10 min）、无需对比剂、可自由手扫描并实现几何无关体积量化，还能显示肿瘤球体、囊肿和坏死区域等内部形态；研究人员称这是首次将自由手3D UHF-US重建用于CAM上实体患者来源组织。局限包括采集依赖操作者、胚胎运动伪影、需手动复核分割、最大穿透深度约10 mm，以及比较分析样本量小、统计仅限描述性。未来可扩展至更大生物队列、其他肿瘤实体、治疗反应评估，并结合多普勒、对比增强/超分辨超声及自动分割。

结论译文：3D UHF-US是一种用于测量移植于CAM的PDAC肿瘤样本的多功能3D成像方法，并得到与3D数字显微镜测量比较评估的支持。其类似于一种非侵入、快速测量方法，用于评估肿瘤形态和体积定量，克服了许多局限，如复杂设置、高成本和注射剂或电离辐射的潜在危害。仍需进一步研究确定该方法对其他人类来源组织类型或肿瘤实体以及CAM模型中潜在治疗测试的适用性。