《Nanoscale Advances》：Polymorphism of amyloid fibrils of a SARS-CoV-2 peptide associated with hemagglutinationOpen Access
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染后可引发长期症状，即“长期COVID”或“COVID-19后状态”，其神经症状与神经退行性疾病相似。淀粉样纤维常参与神经病理过程，来自SARS-CoV-2的多种片段肽，如刺突蛋白192–211（S192
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染后可引发长期症状，即“长期COVID”或“COVID-19后状态”，其神经症状与神经退行性疾病相似。淀粉样纤维常参与神经病理过程，来自SARS-CoV-2的多种片段肽，如刺突蛋白192–211（S192），已被报道可形成淀粉样纤维。1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇（HFIP）和二甲基亚砜（DMSO）等有机溶剂广泛用于溶解淀粉样生成肽，但这些溶剂可能通过初始二级结构影响肽的聚集动力学。因此，确定不同溶剂环境如何影响S192聚集对于理解其结构特征至关重要。本研究发现，S192肽淀粉样纤维在特定溶剂条件下呈现多态性。研究人员将S192肽溶于HFIP，稀释至终浓度2% HFIP并孵育，形成了多种形态的淀粉样纤维。为阐明为何HFIP与DMSO结果不同，研究人员分析了S192肽在HFIP或DMSO中的傅里叶变换红外光谱（FTIR），结果表明两种溶剂中的二级结构构成存在差异。此外，溶解于HFIP中的S192形成淀粉样物的迟滞时间显著短于DMSO条件。这些结果与快速淀粉样纤维形成可能与异质纤维形态相关的假设一致。进一步，研究人员检测了血凝作用以评估S192淀粉样纤维多态性的功能意义。结果显示，由HFIP溶解的S192肽形成的淀粉样纤维呈现多态性，且其血凝活性高于DMSO条件下形成的单一形态纤维。
论文解读：S192肽淀粉样纤维的多态性及其血凝活性研究
一、研究背景与科学问题
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染不仅引起急性症状，还可导致称为“长期COVID”的持续数月甚至数年的多系统症状，其中认知功能障碍、脑雾、运动后不适等神经症状与阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病相似。长期COVID的患病率估计为10%–30%，并可影响年轻人群，造成显著的社会问题。其发病机制可能与微血栓形成、病毒持续感染或自身免疫反应有关。在患者血液中检测到抵抗常规纤溶的淀粉样微血栓，这些微血栓可能阻塞脑毛细血管并损伤神经组织。SARS-CoV-2的刺突蛋白、核衣壳蛋白和包膜蛋白均含淀粉样生成序列，其中刺突蛋白来源肽段S192（序列FVFKNIDGYFKIYSKHTPIN，对应刺突蛋白192–211位）具有高淀粉样生成能力，且已被证实可损伤脂膜并诱导红细胞血凝。然而，S192淀粉样纤维是否表现聚集动力学差异和结构多态性，以及这些多态性如何影响血凝活性，此前尚不清楚。
二、研究内容与主要结论
研究人员系统考察了初始溶解有机溶剂对S192二级结构、淀粉样纤维形成动力学、纤维形态及血凝活性的影响。选用HFIP（强α-螺旋诱导剂）和DMSO（对二级结构影响较小）两种溶剂溶解S192，稀释至终浓度2%后于37℃孵育24小时。透射电子显微镜（TEM）显示，经HFIP溶解的S192可形成晶体样、直线形和扭曲形等多种形态的淀粉样纤维，而经DMSO溶解的S192仅形成扭曲形纤维。硫黄素T（ThT）荧光动力学实验表明，HFIP条件下S192的迟滞时间显著短于DMSO，表观伸长速率常数更高，说明初始溶剂显著影响成核与纤维伸长过程。圆二色（CD）和傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析显示，S192在100% HFIP中的二级结构随浓度变化，β-折叠比例随浓度升高而增加；而在DMSO中二级结构组成基本恒定。超滤实验提示，600 μM S192稀释至2% HFIP后，溶液中存在大于10 kDa的预组装物种。血凝实验表明，去除残余溶剂后，HFIP来源的多态性淀粉样纤维引起血凝的最低浓度显著低于DMSO来源的单一形态纤维。该研究首次将S192纤维形态多态性与血凝活性差异直接关联，提示快速成核产生的多态纤维可能具有更强的红细胞聚集诱导能力。
三、关键技术与方法
研究采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化合成S192肽，经MALDI-TOF质谱验证纯度。通过透射电子显微镜（TEM）结合负染色观察纤维形态。ThT荧光法监测淀粉样纤维化动力学，并使用方程拟合计算迟滞时间和表观速率常数。利用圆二色（CD）和傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析肽在有机溶剂中的二级结构，FTIR酰胺I带去卷积定量β-折叠、α-螺旋和β-转角比例。通过10 kDa超滤装置评估稀释后S192的聚集状态，并以超速离心收集淀粉样纤维，SDS-PAGE半定量验证纤维中肽含量。血凝实验使用绵羊红细胞，通过U形板倾斜法判断凝集终点，并用显微镜确认红细胞聚集。绵羊血购自Kohjin Bio，无需伦理批准。
四、研究结果
3.1 初始溶解有机溶剂影响S192淀粉样纤维形态
研究人员纯化S192肽后，分别在10% HFIP、2% HFIP和2% DMSO条件下孵育。TEM显示，10% HFIP形成厚晶体样纤维；2% HFIP形成扭曲和直线两种细纤维，且无晶体样纤维；2% DMSO仅形成扭曲纤维。2% HFIP条件表现出高度多态性。
3.2 S192淀粉样纤维形成动力学受初始溶剂影响
ThT实验显示所有条件下均呈现典型S形曲线，但迟滞时间和生长速率不同。在10–40 μM浓度范围内，2% HFIP的迟滞时间（约1.7–2.3小时）显著短于2% DMSO（约4.2–4.7小时），且kapp在多数浓度下更高。浓度依赖性不显著，表明初始溶剂而非肽浓度主导动力学差异。
3.3 S192肽二级结构取决于初始有机溶剂
CD光谱显示，S192在HFIP中呈α-螺旋特征（193 nm正峰、206 nm双极小值），且随浓度增加峰强度升高。FTIR分析表明，随着HFIP中S192浓度升高，β-折叠比例增加，β-转角比例减少；而在DMSO中两者比例保持约40%不变。两种溶剂中α-螺旋含量均约20%。超滤实验显示，600 μM S192在2% HFIP中的可过滤单体回收率显著低于2% DMSO，提示HFIP稀释路径产生更多高分子量聚集体。
3.4 HFIP溶解形成的S192淀粉样纤维具有高血凝活性
超速离心去除残余溶剂后，SDS-PAGE确认纤维中肽含量与单体对照相当。血凝实验结果显示，HFIP来源纤维的血凝终点浓度（最低致凝浓度）显著低于DMSO来源纤维，后者终点浓度范围宽（25–200 μM）。显微镜观察确认阳性孔中红细胞团簇存在，阴性对照无聚集。
五、总结与结论
讨论部分指出，HFIP降低成核能垒，使S192快速形成多个核，进而产生多态纤维；DMSO则导致缓慢成核，使结构弛豫至单一扭曲形态。S192在HFIP中表现出的浓度依赖性二级结构变化提示其存在预纤维化环境。尽管CD和FTIR在纯溶剂中测量，但稀释实验表明初始溶剂确实影响后续组装状态。此前研究仅评价了DMSO条件下S192纤维的血凝活性，且未去除残余单体/寡聚体；本研究通过超速离心纯化纤维，首次证明形态多态性直接与血凝活性差异相关。研究结论为：初始溶解溶剂显著影响S192肽二级结构，进而决定淀粉样纤维形态；HFIP溶解的S192表现出较短迟滞时间、纤维多态性和增强的血凝活性。由于尚未获得纯直线形纤维，血凝作用是由直线形纤维单独引起还是由多态混合物引起仍需进一步研究。未来建立单形态纤维分离方法将有助于阐明S192纤维形态与长期COVID之间的关联。
