A9衍生HER2靶向肽功能化载钆脂质体用于乳腺癌分子MRI

《Nanoscale Advances》：Peptide-functionalized gadolinium liposomes enable HER2-targeted molecular MRI of breast cancerOpen Access

　　

HER2（人表皮生长因子受体2，human epidermal growth factor receptor 2）阳性乳腺癌的靶向分子磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）仍具挑战，因为传统钆基对比剂（gadolinium-based contrast agents, GBCAs）敏感性有限。在此，研究人员开发了多功能载钆脂质体，其经A9衍生的HER2靶向肽功能化，以实现选择性肿瘤识别并增强MRI性能。该脂质体表现出良好的胶体稳定性、较游离Gd-DTPA增强的弛豫率以及可忽略的细胞毒性。表面功能化显著增加与HER2过表达BT-474细胞的结合，其中肽功能化脂质体显示最高亲和力。在初步HER2阳性乳腺癌异种移植模型中，肽靶向脂质体显示肿瘤摄取和持续MRI对比增强，而非功能化脂质体显示较低的肿瘤对比增强。这些初步观察支持进一步研究肽功能化载钆脂质体，作为HER2靶向成像及未来诊疗一体化（theranostic）应用的有前景分子MRI平台。

HER2（人表皮生长因子受体2）属于HER家族，虽无已知配体，但可与HER1、HER3、HER4形成同二聚体和异二聚体；约20–25%浸润性乳腺癌存在HER2基因扩增和/或蛋白过表达，构成HER2阳性亚型，该亚型预后较差、早期死亡率较高、转移较多且无复发生存较短。HER2已成为乳腺癌已验证治疗靶点，针对其胞外域（extracellular domain, ECD）的单克隆抗体相继开发。治疗个体化需可视化并定量药物向靶部位递送，主动靶向有助于减少脱靶效应并提高疗效。目前HER2状态判定依赖侵入性组织取样后免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）和/或荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH），但受活检质量、肿瘤异质性和病理判读影响。非侵入影像可捕获整体肿瘤微结构和异质性，补充病理评估并减少采样误差；MRI在乳腺癌评估中应用增加，但缺乏直接组织检测的分子特异性。脂质体脂双层可整合成像探针与靶向配体，且物化性质可调。将顺磁Gd(iii)复合物掺入脂质膜可提高局部顺磁中心浓度并改善MRI响应。传统GBCAs存在安全性问题，尤其某些线性GBCA螯合稳定性较低、可能释放游离钆离子；严重肾功能损害者发生肾源性系统性纤维化（nephrogenic systemic fibrosis, NSF）的风险仍受关注；传统钆螯合物血液清除快，限制成像窗口及动态过程或小病灶检测。A9（QDVNTAVAW-NH₂）为C端酰胺化九残基肽，可特异结合HER2，是HER2靶向成像与治疗中单抗或其片段的候选替代；其疏水性可能致非特异结合和溶解度有限，但脂质体偶联可通过多拷贝多价作用及聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）spacer缓解，并改善水溶性和循环性能。基于此，研究人员开发载Gd脂质体并表面展示A9类似HER2靶向肽，以期选择性识别肿瘤并增强MRI性能，初步评价其作为HER2靶向分子MRI平台的可行性。

研究人员合成A10（Cys-A9），设计A12（在QDVNTAVAW与Cys间引入两个PEG单元），制备Lipo-Gd-Mal及荧光标记Lipo-Gd-Mal-Rhod，经后插入Michael加成将肽偶联到DSPE-PEG2000-maleimide表面。结果表明该平台粒径为纳米级、分布较窄、胶体稳定，Gd掺入且弛豫率高于游离Gd-DTPA，细胞毒性可忽略；A10功能化脂质体对HER2过表达BT-474细胞结合最高，在HER2低表达BT-549细胞无明显增加；在初步HER2阳性乳腺癌异种移植模型中，A10靶向脂质体显示肿瘤摄取和持续MRI对比增强，非功能化脂质体增强较低。该研究将主动分子靶向与脂质体高载荷Gd的MRI信号放大结合，为HER2靶向分子MRI及未来诊疗一体化提供初步依据。

关键技术方法概述：采用薄膜水化-挤出法制备Lipo-Gd-Mal及荧光标记Lipo-Gd-Mal-Rhod；以DSPE-PEG2000-maleimide经Michael加成后插入偶联A10/A12靶向肽，凝胶过滤分离并用UV-Vis计算偶联效率；采用动态光散射（DLS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、扫描电子显微镜（SEM）和低场核磁共振（LF-NMR）表征粒径、形态、胶体稳定性及弛豫性能；以MTS法在BT-474细胞评价细胞毒性，以荧光激活细胞分选（FACS）在HER2高表达BT-474和低表达BT-549细胞评价结合；建立BT-474皮下异种移植NU/NU雌鼠模型（BT-474由CEINGE-Biotecnologie Avanzate “Franco Salvatore”细胞培养设施提供，BT-549购自ATCC，NU/NU小鼠购自Charles River Laboratories），于9.4 T MRI行体内对比增强评价。

2.1 肽合成：通过化学合成制备A10（Cys-A9）；设计A12在活性序列与Cys间引入两个PEG单元，以增加与脂质体表面距离和靶向配体柔性。
2.2 脂质体制备与表征：制备MRI用Lipo-Gd-Mal及FACS用Lipo-Gd-Mal-Rhod，经后插入Michael加成偶联A9肽，偶联效率为91.5%（A10）和92.3%（A12），肽/总脂摩尔比为0.0128和0.0129；设计目标为粒径低于200 nm、多分散指数（PDI）≤0.2。
2.2.1 DLS分析：DLS显示平均Z-average直径为95.6 ± 10.2 nm，PDI为0.14–0.20，ζ电位由-2.89 mV变为-7.66 mV（A10）和-9.82 mV（A12），30天后尺寸无明显变化，提示胶体稳定，肽功能化未显著改变粒径。
2.2.2 NTA分析：NTA主群约100 nm，平均直径98.7–108.8 nm，与DLS一致；颗粒浓度约10¹⁴/mL；功能化未显著改变整体物化特性，ζ电位变化与表面修饰一致。
2.2.3 SEM分析：SEM显示主要呈球形囊泡、直径低于100 nm，与DLS/NTA一致；可见聚集体可能源于样品沉积、干燥和喷镀；能量色散X射线光谱（EDS）元素映射显示Gd信号与脂质体结构重叠，支持Gd掺入。
2.2.4 LF-NMR表征：LF-NMR在20 MHz、310 K及四个Gd浓度下显示脂质体纵向弛豫率（R₁）高于同浓度Gd-DTPA；纵向弛豫率（r₁）为Lipo-Gd 9.36 ± 0.18、A10 8.93 ± 0.17、A12 8.81 ± 0.16 mM^?1 s^?1，Gd-DTPA为3.73 ± 0.16 mM^?1 s^?1；肽功能化未显著影响弛豫行为，支持MRI应用潜力。
2.3 体外研究：使用HER2过表达BT-474与HER2低表达BT-549细胞。
2.3.1 细胞毒性：MTS法48 h显示Lipo-Gd细胞活力与未处理对照基本不变，功能化脂质体不降低细胞活力，A10/A12组高于未处理细胞，提示生物相容性良好，A10略优。
2.3.2 结合实验：FACS显示BT-474细胞结合率A10为54.9%、A12为44.7%、非功能化脂质体为20.2%；BT-549细胞仅弱信号且无显著增加；中位荧光强度（median fluorescence intensity, MFI）在BT-474中A10/A12分别为非功能化脂质体的3.6/3.9倍，在BT-549中仅1.07/1.05倍；A10结合最高，故选入体内研究。
2.4 体内研究：BT-474皮下接种NU/NU雌鼠，高频超声（high frequency ultrasound, HFUS）监测示5只中3只约3个月成瘤；3只盲法随机静脉注射游离Gd-DTPA、Lipo-Gd-Mal或Lipo-Gd-Mal-A10，150 μL、20 mM Gd、3 μmol Gd/鼠；9.4 T T₁加权RARE序列多时间点成像显示Gd-DTPA注射后立即最大增强，A10脂质体约2 h达相当增强，非功能化脂质体仅有限增强；提示A10功能化可能促进肿瘤蓄积，可行性需更大样本验证。

讨论部分总结：该平台将GBCA掺入脂质双层并以A9类似肽实现HER2主动靶向；脂质体较游离Gd-DTPA提高r₁，与Gd复合物掺入双层后旋转迁移率降低一致，肽功能化未显著干扰弛豫性能；A10较A12显示更高结合，体内初步结果支持A10功能化脂质体用于HER2阳性肿瘤MRI区分，但样本量小，需进一步验证；载药后可包封于水性核心或脂质双层，借助掺入GBCA以MRI无创监测递送，表面肽配体促进HER2受体选择性蓄积，具备诊疗一体化潜力。

研究结论部分翻译：研究人员成功开发了一种HER2靶向选择性脂质体平台，其整合了两亲性Gd(iii) MRI对比剂，并在外部衍生A9肽类似物。该设计利用每个脂质体内掺入的高载荷对比剂，将主动分子靶向与MRI信号放大相结合。所得制剂在尺寸、形态和胶体性质方面得到全面表征。此外，所有开发制剂在所采用实验条件下均显示良好生物相容性和可忽略的细胞毒性。通过流式细胞术评价其靶向能力，证明对HER2表达细胞的选择性识别，并证实表面偶联的肽配体保留了与有效受体结合相容的取向。此外，在HER2+乳腺癌异种移植小鼠模型中的初步概念验证体内研究表明，载钆靶向脂质体可能使MRI能够区分肿瘤组织与周围健康组织。这些初步发现还凸显了该多功能脂质体平台作为化疗药物体内诊疗递送系统的潜力，但仍需更大样本量研究来研究和验证这些效应。实际上，治疗药物可根据其溶解度或其他理化性质包封于水性核心或掺入脂质双层；药物递送可通过掺入的GBCA经MRI无创监测，而表面展示的肽配体特异识别并结合HER2受体，促进肿瘤部位选择性蓄积。这种整合诊疗方法将靶向药物递送与无创成像相结合，为图像引导癌症治疗和个性化医学提供了有前景的策略。