马匹因其关节尺寸、软骨厚度及自然发病情况与人类相近，可作为人类骨关节炎（osteoarthritis, OA）的转化医学模型。microRNA-181a-5p的过表达已被证实参与OA软骨降解过程，利用锁核酸修饰的反义寡核苷酸（locked nucleic acid antisense oligonucleotides, LNA-miR-181a-5p ASOs）抑制其功能代表了一种潜在的治疗策略。本研究评估了在临床正常马匹球节关节中关节内（intraarticular, IA）注射LNA-miR-181a-5p ASO的安全性。12匹马被随机分配接受两次间隔28天的关节内注射，分别给予低剂量[2000?μg（n?=?6）]或高剂量[4000?μg（n?=?6）]的LNA-miR-181a-5p ASO。在56天的观察期内，评估指标包括体格检查、关节评估（积液、周径、温度）、跛行评分及生物流体分析。体格检查和跛行评估指标在各时间点与基线相比均无显著差异，且不受剂量影响（p?>?0.05）。高剂量组在注射后第3天关节积液轻度增加（p??0.05）。每次注射后第3天观察到一过性、与剂量无关的有核细胞计数升高（p??0.05）。尽管高剂量组TNF-α浓度较高（p?
论文解读
一、研究背景与意义
骨关节炎（osteoarthritis, OA）是一种常见且致残的退行性关节疾病，全球患病人数超过6亿。在加拿大，预计到2045年关节炎患者将超过1000万，且随着人口老龄化这一数字还将进一步上升。然而，目前尚无获批的改善病情抗骨关节炎药物（disease-modifying drugs）能够延缓或阻止OA的进展，药物治疗仍局限于症状缓解，关节置换是终末期唯一的干预手段。因此，开发既能缓解症状又能改变疾病进程的治疗方案具有迫切的临床需求。
OA是一种全关节疾病，其特征为进行性关节软骨丢失、滑膜炎症和软骨下骨重塑。在分子水平上，细胞外基质稳态的破坏通过基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）和聚集蛋白聚糖酶活性的增加，以及细胞因子介导的炎症和NF-κB通路的激活驱动疾病进展。微小RNA（microRNAs/miRNAs）是一类在转录后水平调控基因表达的小型非编码RNA，是这些分子通路的关键调控因子。miRNA表达失调可导致关节稳态破坏和OA发病。研究团队前期研究发现，miR-181a-5p在人类关节突关节OA软骨中表达升高，且与MRI和组织学退变分级相关。体外实验表明，IL-1β刺激人软骨细胞可增加miR-181a-5p表达，进而促进炎症基因表达升高、II型胶原减少和软骨细胞凋亡增加。将miR-181a-5p模拟物直接注射入啮齿动物关节可产生OA样病变。相反，使用LNA-miR-181a-5p ASO处理IL-1β刺激的人OA软骨细胞和软骨外植体，可下调MMP-13表达和凋亡标志物；在大鼠关节突关节OA模型和小鼠膝关节OA模型中，关节内注射LNA-miR-181a-5p ASO均能减轻软骨退变。
然而，在更接近人类关节的临床前大型动物模型中，直接关节内递送LNA-miR-181a-5p ASO的安全性尚未得到评估。马匹因其自然关节疾病和跛行的负担较大、关节尺寸和软骨厚度与人类相近，以及转化医学中的整体临床相关性，成为研究OA的独特模型。因此，在马匹中评估新型关节内治疗具有双重意义：既能推动马OA研究进展，又能为向人类转化提供安全性和可行性数据。研究团队假设，在临床正常马匹球节关节中重复关节内注射LNA-miR-181a-5p ASO不会引起不良反应。
二、主要技术方法
本研究选用加拿大圭尔夫大学研究畜群的12匹混种马（10匹母马、2匹去势公马，平均年龄14.7±6.1岁）。入组标准为双前肢美国马术从业者协会（American Association of Equine Practitioners, AAEP）跛行分级不超过1/5级，并经体格检查、血液学和血清生化检测确认临床健康，影像学检查排除关节疾病。研究采用随机对照设计，每匹马随机分配一侧前肢球节关节，接受两次间隔28天的关节内注射，剂量为2000 μg或4000 μg LNA-miR-181a-5p ASO（溶于2 mL生理盐水），对侧未治疗球节作为对照。评估方法包括：主观跛行评分（改良AAEP分级）和客观惯性运动传感器跛行分析系统（Lameness Locator）；关节积液评分、周径测量和皮肤温度测定；血液学及血清生化分析；滑液细胞学检查（总核细胞计数TNCC、总蛋白TP、细胞分类计数）以及ELISA法检测滑液细胞因子（IL-1β、TNF-α、PGE2）浓度。统计分析采用广义线性混合模型，以马匹为随机效应，剂量、时间及其交互作用为固定效应，半定量数据采用Wilcoxon符号秩检验和秩和检验。
三、研究结果
3.1 一般体格检查参数
在所有评估时间点，一般体格检查变量均保持在临床健康成年马的正常参考范围内。心率随时间有差异（p=0.002）但不受剂量影响；呼吸频率和直肠温度在时间、剂量及剂量-时间交互作用方面均无显著差异。
3.2 关节积液、周径、温度和触诊反应
低剂量组关节积液评分在任何时间点与基线相比均无差异。高剂量组在第3天积液评分较基线升高（中位数变化0.5级；p=0.048），但各剂量组间在任何时间点均无差异。关节周径不受时间、剂量或交互作用影响。球节皮肤温度随时间有差异（p=0.005）但不受剂量影响。所有马匹在触诊时均无疼痛反应。
3.3 跛行评估和被动关节屈曲反应
主观AAEP跛行评分在低剂量组和高剂量组内各时间点与基线相比均无差异，组间亦无差异。被动关节屈曲反应评分在各剂量组内和组间均无显著差异。客观跛行评估（向量和VS值）不受时间、剂量或交互作用影响；屈曲后VS值同样无显著差异。
3.4 血清生化和全血细胞计数
血清氯离子和血清淀粉样蛋白A浓度存在剂量-时间交互作用（p=0.02和p=0.04），但配对比较均未达显著性。高剂量组红细胞压积较低剂量组低0.032±0.012 L/L（p=0.03）。除血清钾、游离胆红素、总胆红素和谷氨酸脱氢酶外，其余所有血清生化和血常规指标均值均保持在参考范围内。上述超出参考范围的指标在基线时即已存在。
3.5 滑液总核细胞计数和总蛋白
滑液总蛋白在整个研究期间保持在20 g/L以下，未进行统计分析。滑液总核细胞计数随时间有显著差异（p=0.006），表现为每次注射后第3天一过性升高，但不受剂量或交互作用影响。仅6份样本超过3.0×109/L，最高为4.4×109/L。
3.6 滑液PGE2、IL-1β和TNF-α浓度
所有细胞因子数据经对数转换后分析。大部分样本（49/60）低于PGE2检测下限（39 pg/mL），PGE2不受剂量或交互作用影响。所有样本（60/60）均低于IL-1β检测下限（125 pg/mL）。TNF-α浓度在各匹马间变异较大，高剂量组TNF-α浓度较高（p=0.0016），但无剂量-时间交互作用（p=0.20）。超过检测上限的样本全部来自低剂量组的两匹马，且基线时即已升高并持续整个研究期。
四、讨论与结论
本研究结果与假设一致：在临床正常马匹球节关节中，间隔28天重复关节内注射2000 μg和4000 μg的LNA-miR-181a-5p ASO，在56天研究期内通过系列体格检查、血液学和生化分析、跛行评估及滑液评估均表现出良好的耐受性。啮齿动物模型虽对推进OA治疗机制理解和概念验证数据至关重要，但其关节尺寸小、软骨薄（50–150 μM），与人类软骨厚度（1.5–2.5 mm）存在显著解剖差异，可能影响关节内药物摄取和跨软骨扩散。马匹的关节尺寸和软骨厚度（1.5–2 mm）更接近人类，具有更高的转化相关性。
高剂量组在第3天出现的轻度一过性关节积液增加，属于关节穿刺术后公认的轻度自限性炎症反应，但本研究未设对照组，无法明确归因于穿刺、正常生物学变异或治疗本身。滑液TNCC的轻度一过性升高与既往报道的常规关节穿刺术后反应一致。滑液细胞因子浓度大多低于检测下限，与既往健康马关节研究一致，表明关节内注射LNA-miR-181a-5p ASO未诱导可测量的炎症反应。血清生化和血液学结果总体无异常，虽然谷氨酸脱氢酶、钾、游离和总胆红素在某些时间点略高于参考区间，但这些偏差在治疗前基线时即已存在。鉴于ASO类药物已知的安全性考量（全身给药可引发补体激活、细胞因子释放和剂量依赖性肝毒性），本研究观察到的无异常血液学结果具有重要意义。
综上所述，关节内注射LNA-miR-181a-5p ASO在临床正常马匹球节关节中具有良好的安全性和耐受性，仅出现一过性轻度炎症反应，支持其作为潜在OA治疗方案的进一步临床前和临床评估。
