瞬态红外光谱揭示单体LOV组氨酸激酶EL346的连续结构变化

《Physical Chemistry Chemical Physics》：Sequential structural changes in the monomeric LOV histidine kinase EL346 revealed by transient infrared spectroscopyOpen Access

　　

光-氧-电压（LOV）结构域是黄素结合的光受体蛋白，它们介导细胞对蓝光的响应。LOV结构域通常作为多结构域蛋白中的结构开关来传递信号，其精确机制由特定的多结构域架构决定。已有几种不同的LOV信号传导模型被归类，但对LOV信号传导的理解仍然是该领域的一个挑战。研究人员研究了多结构域光受体EL346，该蛋白将LOV结构域与组氨酸激酶效应结构域偶联。其独特的单体结构使其区别于经典的、二聚体LOV组氨酸激酶——后者通过完全不同的结构途径发挥作用。研究人员展示了瞬态红外光谱数据，揭示了激活发生的时间尺度。通过研究分离的核心LOV结构域，研究人员能够分离出来自组氨酸激酶输出结构域的信号贡献。数据揭示了在约10 μs时与加合物形成同时出现的α-螺旋结构重排。研究人员还鉴定出约3 ms的第二个动力学步骤，在该步骤中α-螺旋元件经历最终的结构适应。这些数据将EL346激活过程中的结构事件序列与其他LOV多结构域信号传导模式联系起来，支持一种类似于AsLOV2的机制——在该机制中，信号传导通过结合在LOV结构域β-折叠片表面的螺旋进行。这些数据补充了已知的不同LOV信号传导模式目录，有助于更好地理解受体与效应结构域之间的信号传递。

论文解读：单体LOV组氨酸激酶EL346的连续结构变化

1. 研究背景与科学问题

光-氧-电压（Light-Oxygen-Voltage，LOV）结构域是一类以黄素单核苷酸（FMN）或核黄素（RBF）为辅基的光受体蛋白，广泛存在于原核生物、真菌和植物中，介导蓝光引发的细胞响应。尽管LOV结构域及其光化学过程高度保守，但LOV结构域常作为多结构域蛋白的一部分，通过多种不同的机制实现信号转导。目前，LOV信号传导模型可大致分为几类：以phototropin的AsLOV2为代表的“螺旋解离”模式，LOV结构域直接结合一个C端Jα-螺旋，光激活后释放该螺旋；以YtvA和YF1为代表的二聚体LOV组氨酸激酶模式，通过平行卷曲螺旋连接体的超螺旋旋转将结构变化传递至效应结构域；此外还有VVD、EL222等通过调节结合界面或二聚化状态实现信号输出的例子。然而，仅有少数LOV系统被深入研究，LOV多结构域信号传导的精确机制仍然是该领域的挑战。

EL346是一种单体LOV-组氨酸激酶（histidine kinase，HK），其结构独特：LOV结构域通过一个大的结合界面直接结合其两个N端α1和α2螺旋（即二聚化/组氨酸磷酸转移类似（DHpL）结构域），而催化/ATP结合（CA）结构域位于另一侧，将整个复合体维系在一起。由于这种结合构象，EL346在暗态下大部分处于抑制状态，CA结构域无法自由地对DHpL结构域中的活性位点组氨酸进行磷酸化。已有研究表明，光激活后EL346的DHpL结构域溶剂可及性增加、整体运动性和无序性增强，活性提高约1.6倍，但激活过程中结构事件的先后顺序尚不清楚。为此，研究人员利用瞬态红外光谱技术，在皮秒至数百毫秒的时间尺度上追踪EL346激活过程中的结构重排，以期阐明其信号传导机制。

2. 研究内容与结论

研究人员记录了全长EL346及其分离的LOV结构域（LOV(EL346)）在蓝光激活后的瞬态红外光谱数据，覆盖酰胺I和酰胺II区域（1550–1740 cm^-1），时间跨度从皮秒至600 ms。通过全局拟合，获得三个时间常数：τ1≈2 ns（核黄素辅因子从激发单重态到三重态的系间窜越）、τ2≈9 μs（半胱氨酸加合物形成）以及τ3≈3 ms（一个额外的毫秒级过程）。为了分离输出结构域的信号贡献，研究人员将全长与LOV-only数据归一化后相减，得到双差谱，从而排除LOV结构域内部光物理过程的干扰。结果表明，在约10 μs的加合物形成步骤中，DHpL结构域（可能还包括CA结构域）中的α-螺旋元件发生明显的结构重排，表现为1643 cm^-1负信号和1656 cm^-1正信号的特征峰对；随后的约3 ms过程中，α-螺旋信号进一步演化，提示DHpL和CA结构域最终适应完全激活的构象。加入ATP类似物AMP-PNP后，三个时间常数基本不变（τ1=1.5 ns、τ2=9.5 μs、τ3=2.6 ms），双差谱特征也类似，表明AMP-PNP对激活路径和动力学没有可检测的影响。与二聚体LOV组氨酸激酶YF1的已知双差谱相比，EL346的α-螺旋特征峰频率更高（~1643 cm^-1 vs. 1632 cm^-1），反映了暗态下DHpL结构域被LOV和CA结构域包裹、溶剂暴露较低。这一结果支持EL346的激活机制更接近AsLOV2样信号传导模式，即通过调节结合在LOV结构域β-折叠片表面的α-螺旋结构域来实现信号输出，而非如YF1那样通过卷曲螺旋旋转。该研究将EL346的激活时间序列与其他LOV多结构域信号模式联系起来，丰富了LOV信号传导模式的已知目录，为理解受体与效应结构域之间的信号传递提供了重要数据。

3. 关键技术与方法

研究人员使用了以下几种主要技术方法：（1）瞬态红外光谱（transient IR spectroscopy）：利用两套电子同步激光系统，以420 nm可见光作为泵浦脉冲，~1650 cm^-1红外光作为探测光，结合2×32像素MCT检测器，实现皮秒至1秒时间分辨的瞬态吸收测量；样品通过自建停流电路在每个激发脉冲前更换新鲜溶液，以避免光降解。数据采用顺序模型进行全局拟合，并利用线性梯度融合两套不同重复率的数据集以覆盖宽时间范围。（2）傅里叶变换红外光谱（FTIR）：使用Vertex 80v FTIR光谱仪记录稳态暗态和光照后的差谱，用于验证瞬态结果。（3）双差谱分析：将全长EL346与截短LOV(EL346)的瞬态数据按1546 cm^-1漂白信号归一化后相减，以消除LOV结构域本身的贡献，突出输出结构域的构象变化。（4）定点突变与蛋白表达：蛋白在CpxRibF细胞中表达，经Ni亲和色谱和凝胶过滤纯化，缓冲液置换至D₂O；样品浓度约1 mM。部分实验加入5 mM AMP-PNP和MgCl₂以研究核苷酸结合的影响。

4. 研究结果

4.1 输出结构域的结构变化

通过比较全长EL346和LOV(EL346)的瞬态光谱并计算双差谱，研究人员发现单重态和三重态的光谱贡献基本相互抵消，表明核黄素辅基的光物理过程在两种构建体中基本相同。在约10 μs的加合物形成步骤中，双差谱出现显著的负信号（~1643 cm^-1）和正信号（~1656 cm^-1），落在α-螺旋特征频率区域，说明输出结构域在加合物形成的同时发生α-螺旋重排。该重排最可能位于完全α-螺旋的DHpL结构域，也可能涉及DHpL与CA结构域之间的α-螺旋界面。此外，在1546、1697和1718 cm^-1处还观察到较小的正信号，在~1580 cm^-1处为负信号，可能涉及天冬氨酸/谷氨酸侧链羧基或天冬酰胺/谷氨酰胺侧链酰胺基团的微环境变化。

4.2 毫秒级过程

全长EL346的数据在毫秒时间尺度上出现第二次谱学演化，表现为~1630 cm^-1瞬态向高波数展宽，影响~1660 cm^-1漂白信号。从100 μs到20 ms的双差谱ΔΔA(20ms–100μs)显示，在1643 cm^-1处有一个明显的正信号，两侧为1630 cm^-1和1670 cm^-1的负信号，覆盖α-螺旋、β-折叠、转角及无序结构的典型频率，提示该过程可能涉及整个效应结构域。而LOV(EL346)的对应计算仅产生微小无特征的基线偏移，表明该毫秒级过程仅存在于全长蛋白中，定位于输出结构域。全局拟合加入该动力学步骤后得到τ3≈3 ms。快速扫描测量（37 ms至10 s）未发现进一步的谱学演化，因此激活过程在3 ms后基本完成。

4.3 AMP-PNP的影响

在加入AMP-PNP和MgCl₂后，瞬态光谱显示出与无AMP-PNP时相同的过程，时间常数分别为τ1=1.5 ns、τ2=9.5 μs和τ3=2.6 ms。ΔΔA(20ms–100μs)双差谱与无AMP-PNP时相似，1643 cm^-1处出现清晰峰，仅两侧负信号不如不加时明显。100 μs和20 ms光谱的细微差异可能表明AMP-PNP使构象变化略有改变，但总体差异很小，说明AMP-PNP在可检测范围内不影响EL346的激活路径和时间尺度。

5. 讨论与结论

讨论部分将EL346与YF1和AsLOV2两种已充分研究的LOV信号传导模式进行比较。EL346和YF1均属于LOV-组氨酸激酶家族，但YF1为二聚体，其Jα螺旋延伸为卷曲螺旋连接体；EL346为单体，其α1和α2螺旋直接结合在LOV结构域的β-折叠片表面。双差谱中，YF1在1632(?)/1643(+) cm^-1处出现与加合物形成同时出现的漂白/瞬态对，而EL346的相应特征位于~1643(?)/1656(+) cm^-1。EL346中较高的漂白频率可能源于暗态下DHpL结构域被两侧结构域遮蔽而溶剂暴露较低，以及跃迁偶极耦合的影响。然而，光激活后DHpL螺旋的溶剂暴露增加应当引起红移，而观测到的是蓝移，研究人员推测这可能是部分螺旋结构解离与溶剂化作用相互竞争的结果，具体机制尚需借助小角X射线散射等互补手段进一步研究。

EL346的结构域组织与AsLOV2类似：AsLOV2的LOV核心在β-折叠片界面结合C端Jα螺旋和N端A′α螺旋，而EL346的β-折叠片表面则由α1螺旋、N端A′α螺旋以及α2螺旋占据。在AsLOV2中，光激活后FMN加合物形成导致附近谷氨酰胺（Q513）侧链翻转，破坏β-折叠片表面并最终使Jα螺旋完全解折叠，该过程在~10 μs时已耦合到Jα螺旋的结构变化，而完全解折叠发生在~300 μs。EL346在加合物形成时也观察到α-螺旋变化，但毫秒级过程中的光谱变化幅度仅为加合物态差信号的~30%，远小于AsLOV2的Jα解折叠信号。这一较小的变化可能表明DHpL螺旋并未完全解折叠，或者仅有少部分蛋白转变为活性构象。由于EL346是包含CA结构域的全长蛋白，CA结构域结合在DHpL结构域上可能限制了螺旋的完全解折叠。研究人员推测，毫秒级过程可能对应于DHpL与CA结构域的最终解离步骤，使蛋白达到完全激活状态。

总而言之，该项研究通过瞬态红外光谱揭示了EL346激活过程中的两个主要的蛋白结构转变步骤：约10 μs时伴随加合物形成的α-螺旋扰动，以及约3 ms时输出结构域的最终结构适应。这些结果将EL346的激活机制归入AsLOV2样信号传导模式，并表明α-螺旋转导子的响应程度和动力学具有高度可变性和结构依赖性。该研究为理解LOV多结构域光受体的信号传递机制提供了新的时间分辨信息，所采用的双差谱方法也为其他光感受器蛋白的机制研究提供了有力工具。