连续流合成与在线红外监测的亚胺及仲胺衍生物：表征、抗氧化活性、ADMET及分子对接研究

《Organic and Biomolecular Chemistry》：Continuous flow synthesis, characterisation and antioxidant activity of imine and secondary amine derivativesOpen Access

　　

研究人员报告了一系列由2,4,6-三甲基苯胺与苯甲醛衍生物合成的新型亚胺（imines）和仲胺（secondary amines），合成采用连续流技术（continuous flow technology）并结合在线红外（in-line IR）监测。在亚胺合成中，苯甲醛与2,4,6-三甲基苯胺在45 °C、约5 min内达到95%转化率（conversion）。随后在连续流反应条件下成功构建了19个新型亚胺库，转化率为43–92%。所建立的方法进一步用于经还原胺化（reductive amination）串联连续流合成19个仲胺，总停留时间（residence time）为45 min，转化率为31–94%。采用SwissADME和pkCSM-pharmacokinetics网络工具计算的亚胺和仲胺计算机模拟ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）特征在Lipinski规则和Verber规则范围内对大多数化合物可接受。采用DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，2,2-二苯基-1-苦基肼）自由基清除实验评价这些化合物的抗氧化活性时，发现亚胺化合物具有中等抗氧化活性（31–55%），而仲胺活性较低（23–39%）。分子对接（molecular docking）研究还表明，所有合成化合物均与人抗氧化酶受体3MNG发生结合相互作用，亚胺的对接评分范围为?3.623至?2.207 kcal mol^?1，胺为?3.966至?2.716 kcal mol^?1。

研究背景与问题：亚胺（imines）和胺类化合物是天然产物、合成中间体及药物中的重要构建单元，广泛用于医药、农药、催化及配位化学，并可作为含氮杂环合成的关键中间体。传统亚胺合成多经羰基化合物与伯胺的可逆缩合完成，需使用MgSO₄、Na₂SO₄、原甲酸三甲酯、分子筛或Dean–Stark装置等脱水剂推动平衡，且常需酸性或碱性条件加速；历史方法还存在腐蚀性Lewis酸、反应时间长和收率低等问题。仲胺（secondary amines）可通过胺的直接烷基化或含氮官能团还原制备，但醛/酮还原胺化（reductive amination）更为便捷。基于此，研究人员旨在以连续流技术（continuous flow technology）结合在线红外（in-line IR）监测，对2,4,6-三甲基苯胺与苯甲醛衍生物来源的亚胺和仲胺进行流程合成基准研究，并评价其抗氧化活性、计算机模拟ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）性质及分子对接（molecular docking）相互作用。连续流具有更好混合、缩短反应时间、高效传热传质及便于在线分析等优势，结合计算机辅助药物设计（CADD）有望减少候选药物合成与筛选的时间和资源。

关键技术方法：采用注射泵驱动微反应器（MR-LAB-MS、MR-LAB-V、MR-LAB-VS）构建连续流平台，以在线红外结合OPUS Quant 2校准曲线监测苯甲醛转化，离线HPLC监测胺化；仲胺通过串联连续流还原胺化制备，部分底物以TMSCl活化和NaBH₄还原；产物经核磁共振（NMR）、红外（IR）、高分辨质谱（HRMS）表征，部分经单晶X射线衍射（X-ray crystallography）确认。抗氧化采用DPPH自由基清除实验；类药性采用SwissADME和pkCSM-pharmacokinetics预测；分子对接采用Maestro、Schr?dinger Release 2023-1及Glide SP与人抗氧化酶受体3MNG（PDB ID：3MNG）进行。本研究未涉及临床样本队列。

研究结果：
（1）亚胺衍生物3a–3s的批合成：通过苯甲醛衍生物与2,4,6-三甲基苯胺在室温、无水乙醇中反应发现，空间位阻及苯甲醛上吸电子/给电子基团直接影响反应；给电子取代基底物3f可在3 h内以92%收率形成，3h、3i、3j、3o、3p、3r在3 h内收率51–94%；无取代3a需28 h达93%；吸电子基团（Cl、NO₂、F）底物需18–48 h，收率59–91%；间位吸电子2s仅3 h、45%；空间位阻底物3b、3g、3k、3m需3–5天，收率62–94%。
（2）亚胺3a–3s的连续流合成：通过微反应器流程和在线红外监测发现，最佳条件为1 M、5 min停留时间、45 °C，苯甲醛转化率95%；在优化条件下构建亚胺库，对位吸电子底物及空间位阻底物需10 min，收率43–79%；给电子取代基底物5 min内收率44–71%；间位吸电子2s在短停留时间内以92%收率得到3s。与批合成相比，连续流将反应时间缩短至5–10 min，NMR收率43–92%，而批合成需3 h至5天、收率45–94%。3a放大反应以87%分离收率得到产物，生产能力1.95 g h^?1，时空收率97.5 g h^?1 L^?1，无需纯化；批合成生产能力为0.53 g h^?1。
（3）浓度对苯甲醛转化的影响：通过在25 °C考察1 M、1.5 M、2 M发现，转化率随浓度降低而升高；因亚胺形成为可逆反应，浓度增加使水平衡后移；1 M为最佳浓度，5 min转化率95%。
（4）停留时间对苯甲醛转化的影响：通过25 °C、1 M下考察5–20 min发现，转化率随停留时间增加而略升，由5 min的95%升至20 min的97%。
（5）温度对苯甲醛转化的影响：通过在25–60 °C考察发现，温度对2a至3a的转化率无显著影响。
（6）仲胺衍生物4a–4s的批合成：通过优化溶剂、反应时间和还原剂发现，NaBH₄较Hantzsch酯更合适，分离收率一般91–99%对54%；DMF中91–99%，DCM、DCE、EtOH需更长时间，收率分别为98%、96%、70%；DMF中可达99%。在优化条件下，4a–4s以18–91%收率、总反应时间7 h获得。
（7）仲胺4a–4s的连续流合成：通过采用亚胺优化条件进行串联连续流还原胺化发现，4a在0.5 M NaBH₄、35 min、0 °C下转化率76%；在60 °C、35 min下最高83%；4b–4s以35–97%的HPLC转化率获得，但部分底物转化率较低（1.8–31%）；对给电子取代底物需TMSCl预活化后转化率提高至31–74%，吸电子取代底物无需活化即可达35–94%，NO₂取代2n例外。连续流在45 min、60 °C下获得31–97%的HPLC转化率，而批合成在0 °C、7 h下为19–89%。4a放大以61%分离收率、0.42 g h^?1、时空收率6.98 g h^?1 L^?1获得，优于批合成0.14 g h^?1（7 h、44%分离收率）。
（8）亚胺和仲胺的X射线晶体学表征：通过获得10个亚胺（3a、3g、3j、3l、3m、3n、3p、3q、3r、3s）和3个仲胺（4l、4n、4q）晶体并进行X射线衍射，确认了其结构。
（9）DPPH法评价3a–3s和4a–4s的抗氧化活性：通过DPPH清除实验发现，亚胺3e、3d、3s、3l、3b、3a在5 mg mL^?1下具有中等活性，清除率31–55%，低于抗坏血酸；含吸电子取代基的3e、3d、3s及含羟基的3l、3b活性增强（p < 0.05）；其他含给电子基的亚胺活性低至无，3n无活性可能与空间位阻有关；3c、3k、3p、3q因纯样不足未测。仲胺4l、4e、4b、4r、4f、4s、4j、4a、4i、4m活性23–39%，低于所有受试亚胺（p < 0.05），表明还原为胺后清除活性未改善。
（10）计算机模拟ADMET性质与抗氧化活性评价：通过SwissADME和pkCSM-pharmacokinetics预测发现，所有亚胺和胺均符合Lipinski五规则；亚胺分子量223.31–313.39 g mol^?1、胺225.34–315.41 g mol^?1；亚胺HBD 0–1、胺1–2（<5），亚胺HBA 1–4、胺0–3（<10），可旋转键亚胺2–6、胺3–6（<10）；除3m（log P=5.22）和4m（log P=5.37）外，log P<5；所有化合物人肠道吸收高，亚胺92–95.7%、胺91–94.5%；大鼠口服急性毒性LD₅₀亚胺1.913–2.399 mol kg^?1、胺2.179–3.117 mol kg^?1；除3m、4m、4s外预测无肝毒性。
（11）分子对接分析：通过将3a–3s和4a–4s与3MNG对接发现，亚胺对接评分?3.623至?2.207 kcal mol^?1，胺?3.966至?2.716 kcal mol^?1，均低于参考物（?5.086 kcal mol^?1）；3d、3s、3l及4k、4b、4s、4l显示较好结合；3d与GLY46、THR147形成氢键，3l与LYS49形成氢键及盐桥，3s与GLY46氢键及LYS49卤键，4k与GLY46、THR44氢键，4b与THR147氢键，4s与LEU149卤键，4l与THR147氢键及π–π堆积；对接结果与DPPH实验中3d、3l、3s及4b、4l、4s的活性趋势部分一致。

讨论与结论：研究人员总结了连续流合成亚胺和仲胺的优势：微反应器大表面积体积比和更好混合提高了收率并缩短时间；模型反应方法成功外推至不同底物，亚胺3a–3s在44–92%收率范围内获得，连续流将反应时间缩短至最多10 min；该方法用于串联连续流还原胺化合成相应仲胺，总停留时间45 min；给电子取代亚胺的原位还原需醛预活化以提高转化率（31–74%），CH₃取代物除外；吸电子取代物无需羰基活化即可达35–94%，NO₂取代物例外。ADMET在Lipinski和Verber规则内对多数化合物可接受；亚胺抗氧化活性中等（31–55%），仲胺较低（23–39%）；3e、3d、3s、3l、3b、3a显示中等活性；对接评分亚胺?3.623至?2.207 kcal mol^?1、胺?3.966至?3.022 kcal mol^?1。研究结论指出：高反应性亚胺的合成及反应进程监测并非易事；连续流合成使亚胺合成中的在线反应监测成为可能，而该任务在常规批合成中较困难；由于微反应器较大的表面积体积比和更好混合，反应收率提高且反应时间缩短。模型反应所建立的方法成功外推至不同底物，形成3a–3s，收率44–92%；与批合成需3 h至5天、收率48–94%相比，连续流将本范围反应时间缩短至最多10 min。该方法还被用于串联合成相应仲胺，总停留时间45 min。给电子取代亚胺的原位还原需醛预活化以提高转化率（31–74%），CH₃取代物除外；吸电子取代物无需羰基活化即可达35–94%，NO₂取代物例外。计算机模拟ADMET在Lipinski和Verber规则内对多数化合物可接受；DPPH实验中亚胺抗氧化活性中等（31–55%），仲胺较低（23–39%）；3e、3d、3s、3l、3b、3a相对抗坏血酸显示中等活性。所有合成化合物与3MNG有结合相互作用，亚胺对接评分?3.623至?2.207 kcal mol^?1，胺?3.966至?2.716 kcal mol^?1；亚胺3e、3d、3s、3l、3b、3a结合亲和力?3.623至?2.207 kcal mol^?1，胺4k、4b、4s、4r、4l为?3.966至?3.022 kcal mol^?1，参考物为?5.086 kcal mol^?1。总之，研究人员开发了结合在线反应监测的连续流过程，较批合成缩短亚胺合成时间，并展示了仲胺的串联连续流合成；模型反应在1 h（亚胺3a）和3.27 h（胺4a）运行中未见中断。胺连续流合成的一个可能局限是NaBH₄浓度高于0.5 M时出现沉淀，但这与所用流反应器系统有关；采用能处理固体形成、沉淀和浆液的合适流反应器系统可进一步强化该过程。尽管本工作合成的化合物清除活性较低，但可作为通过衍生化或功能化提高抗氧化活性的基线。