《Frontiers in Genetics》：Clinical characterization and in silico structural analysis of microtubule-related gene variants in eleven patients
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目的：分析微管（microtubules, MTs）突变与神经系统表型的关联，总结TUBA1A、TUBB2A、TUBB4A和TUBGCP6等基因的突变特征，探讨临床表型多样性和分子机制，并扩展MTs基因型-表型谱。方法：纳入11例MTs基因突变患者，收集临床资
目的：分析微管（microtubules, MTs）突变与神经系统表型的关联，总结TUBA1A、TUBB2A、TUBB4A和TUBGCP6等基因的突变特征，探讨临床表型多样性和分子机制，并扩展MTs基因型-表型谱。方法：纳入11例MTs基因突变患者，收集临床资料。采用AlphaFold3进行蛋白质结构预测，并采用FoldX计算突变诱导的能量变化，以评估蛋白质稳定性和构象影响。结果：全面性发育迟缓（global developmental delay, GDD）见于所有个体（11/11，100%），而癫痫发作和结构性脑异常为可变表型特征，分别见于81.8%（9/11；包括8例无诱因癫痫和1例孤立性热性惊厥）和63.6%（7/11）的患者，4例（36.4%）头颅磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）正常。4例TUBA1A患者与严重皮质发育畸形（无脑回、巨脑回）相关，其中2例表现为动态发育倒退；4例TUBB2A患者一致表现为严重发育损害和难治性癫痫（包括婴儿癫痫性痉挛综合征（infantile epileptic spasm syndrome, IESS）和Lennox-Gastaut综合征（Lennox-Gastaut syndrome, LGS）），部分出现声音诱发性反射性发作，随访期间均无发育倒退。2例TUBB4A患者起病年龄差异显著，1例表现为孤立性系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）共观察；1例TUBGCP6患者主要以小头畸形和矮身材为特征，无癫痫。11例患者共鉴定12个变异，包括10个错义变异、1个非经典内含子/剪接变异和1个拷贝数重复。对10个错义变异的蛋白质结构和能量变化预测显示不同程度的自由能增加。基于计算机结构预测，研究人员推测这些突变可能通过改变氢键和构象潜在损害微管功能，代表性例子包括TUBA1A Y172D（能量增加5.15 kcal/mol）和TUBB4A G10S（引入新的氢键相互作用）。结论：本研究描述了携带MTs变异患者的多样临床谱：TUBA1A变异主要见于皮质畸形和潜在发育倒退个体，TUBB2A与严重静态神经发育迟缓和耐药性癫痫相关，TUBB4A与运动障碍相关（其中1例SLE为不寻常共观察），TUBGCP6与原发性生长和发育迟缓相关。计算机结构建模（AlphaFold3和FoldX）提示错义替换可能扰动蛋白质稳定性和局部构象（不同位点ΔΔG值不同）；然而，由于这些变异主要在单个个体中鉴定，这些计算见解代表理论生物物理假设，而非经验证的变异特异性表型特征。仍需进一步功能试验和更大队列以建立明确的基因型-表型相关性。
本研究围绕微管（microtubules, MTs）相关基因变异与神经系统表型的关系展开。MTs参与胞内运输、细胞分裂和运动，其基本单元为αβ-tubulin异二聚体；神经元较其他细胞更依赖MTs完成活动及复杂形态构建。MTs突变可导致神经元迁移和组织异常、分化异常及轴突导向异常等多种脑畸形。既往报道涉及TUBA1A、TUBA4A、TUBB2B、TUBB3、TUBB2A、TUBB、TUBB4A及γ-tubulin基因TUBG1等，临床表型从严重智力障碍和难治性癫痫到学习困难及无癫痫发作不等。现有文献多聚焦单基因报道，神经表型主要集中在皮质发育不良（malformations of cortical development, MCD）。因此，本研究纳入多种MTs基因，总结包括MCD在内的神经表型，分析突变特征、临床表型多样性和分子机制，并扩展MTs基因型-表型谱。研究共纳入11例患者，描述其临床谱并利用计算机结构建模提出突变可能影响蛋白质稳定性和局部构象的理论假设，同时强调这些变异的单例性及计算预测的探索性质。
关键方法：本研究为单中心回顾性队列研究，样本来自北京大学人民医院儿科，2018年1月至2024年12月回顾性筛选因不明原因全面性发育迟缓（global developmental delay, GDD）、智力障碍、难治性癫痫或脑结构畸形就诊的儿科患者，连续纳入11例符合标准先证者。采用trio-based全外显子测序（whole-exome sequencing, WES）并结合Sanger测序或定量方法验证单核苷酸变异、插入缺失或拷贝数变异（copy number variation, CNV）；按ACMG/AMP及ClinGen标准评估致病性，并查询gnomAD、ClinVar、HGMD、Mastermind、DECIPHER及文献。蛋白结构采用AlphaFold3预测，FoldX计算ΔΔG并评估稳定性；出生体重、身长和头围按中国新生儿宫内生长曲线换算百分位和z评分。
研究结果如下。3.1.1 TUBA1A患者：基于临床资料和MRI，4例（P1–P4，3女1男）于3–6月龄起病，均有GDD及明显粗大运动和认知缺陷；P1发热后运动倒退，P3在2岁后认知和运动倒退；P2–P4出现耐药局灶性癫痫，P4兼强直发作并符合LGS，P1无癫痫。MRI显示P3无脑回、P4双侧额顶巨脑回、P2小脑发育不良、P1轻度脑室周围白质软化；P3伴小颌畸形，P4伴垂直距骨。结论为TUBA1A相关表型异质，可见严重MCD及部分发育倒退。3.1.2 TUBB2A患者：4例（P5–P8，3女1男）自新生儿第3天至4月龄起病，粗大运动、表达语言和社交领域严重延迟，随访无动态倒退；均发生癫痫，P6为LGS样难治局灶和强直发作，P7、P8为IESS伴高峰节律紊乱并于约3岁复发为耐药癫痫，P6和P8有声音诱发反射性发作。MRI显示P6额颞顶沟加深并进行性脑萎缩、P7多小脑回畸形、P5和P8正常。结论为TUBB2A以严重静态发育损害和难治性癫痫为主，部分伴声音诱发发作。3.1.3 TUBB4A患者：2例起病年龄差异大，P9为11岁、P10为1岁4月；P9仅有轻度智力障碍和孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD），21岁随访跛行、消瘦、光敏、贫血并独立诊断SLE；P10右下肢跛行易跌倒，右下肢肌力III级、左下肢V级，发育商（developmental quotient, DQ）<50。两者均有局灶性癫痫，P9经拉莫三嗪控制6年后21岁中央顶区局灶发作复发，P10仅两次局灶发作并经丙戊酸和氯巴占控制后3年无发作；脑电图均见Rolandic放电，P10 8岁时放电率70%。结论为TUBB4A可见运动障碍和局灶性癫痫/Rolandic放电，SLE为单一不寻常观察。3.1.4 TUBGCP6患者：P11于1岁3月走路、2岁说“mom”“dad”，2岁6月身高88 cm（<-2SD）、体重11 kg（<-2SD）、头围42 cm（-3SD），不能说简单句而仅用简单叠词，无癫痫，消化和眼等系统无异常。结论为TUBGCP6以生长和发育迟缓、小头畸形和矮身材为主，无癫痫。3.2 突变与蛋白结构变化：基于ACMG/ClinGen分类、trio-WES/Sanger/CMA及AlphaFold3/FoldX，11例共12个变异，包括10个错义、1个非经典内含子和1个微重复；P1–P9为de novo错义变异（P2、P6为嵌合），P10为de novo 2.36 Mb 19p13.3–p13.2重复并包含TUBB4A，P11为TUBGCP6复合杂合（母c.5050A>G p.Ile1684Val，父c.1492-35G>A）。TUBGCP6为常染色体隐性，其余为常染色体显性。3.2.1 TUBA1A位点结构变化：M377I的ΔΔG为1.44 kcal/mol，保留T271主链氢键但丢失F296 Pi-硫相互作用；P175L为1.04 kcal/mol，AlphaFold3示环变化并形成新的L175-K394氢键；T150I为0.50 kcal/mol，保留M154/L153主链氢键但丢失G146侧链氢键；Y172D能量增加最大（5.15 kcal/mol），保留V204/N206主链氢键但A387侧链氢键减少。结论为不同突变经不同结构通路影响稳定性和相互作用，并存在模型依赖的构象变化。3.2.2 TUBB2A位点结构变化：A248V的ΔΔG为0.76 kcal/mol，AlphaFold3示248位环构象变化导致A248主链氧与R46侧链氮氢键丢失，FoldX中该氢键保留；D203E为4.38 kcal/mol，主链氢键稳定但侧链相互作用有模型差异；R262H为3.38 kcal/mol，与E194、N414、E421侧链氢键完全丢失，H262在AlphaFold3与E194、FoldX与E421形成pi-阴离子相互作用；R391H为1.31 kcal/mol，与M388主链氢键不变，原R391和H391侧链无明显相互作用。结论为这些错义变异可能影响蛋白稳定性和关键位点相互作用，细节随建模方法变化。3.2.3 TUBB4A位点结构变化：P10的2.36 Mb微重复包含TUBB4A及邻近基因，故应解释为连续基因重复而非孤立单基因变异；G10S的FoldX ΔΔG为4.31062 kcal/mol，野生型G10与N14、V66形成3个氢键，AlphaFold3突变S10保留这3个氢键并新增与G13、A9的2个氢键。结论为G10S增加能量并改变氢键网络。3.2.4 TUBGCP6位点结构变化：P11携带母源错义和父源剪接受体附近内含子变异；SpliceAI预测规范剪接改变很小（delta≤0.01），AlphaGenome AVI亦低，因无转录验证，父源内含子仍为不确定性变异（variant of uncertain significance, VUS）；结构建模集中于I1684V，FoldX示ΔΔG 0.975 kcal/mol，1684与I1680、I1688主链氢键保留且无异常新侧链相互作用。结论为错义变异仅轻度增加自由能，复合杂合因果暂定。
讨论部分强调，本研究为病例系列，描述TUBA1A、TUBB2A、TUBB4A和TUBGCP6罕见变异的个体表型，并用探索性计算机工具可视化潜在结构影响，而非建立确定性系统基因型-表型矩阵。TUBA1A变异位点与影像异质性相关，但各变异仅见单例且无直接功能实验，结构预测只能作为机制假设。TUBB2A患者未见动态倒退，可能与变异并非C端kinesin结合域改变及随访年龄较短有关。TUBB4A的19p13.3–p13.2重复为连续基因重复，表型不能单独归因于TUBB4A；SLE仅单例，应视为不寻常观察，不能排除偶然共现。TUBGCP6双等位功能丧失通常与常染色体隐性小头畸形伴脉络膜视网膜病变1相关；P11表型较轻，原文提出错义等位与漏性低功能内含子等位共同作用的假设，但因缺乏RNA测序或minigene验证，父源变异仍为VUS，复合杂合因果暂定。计算机预测的ΔΔG范围较宽且与临床严重度、癫痫难治性或皮质畸形无直接线性相关；AlphaFold3和FoldX存在静态模型、经验力场、未模拟GTP/GDP水解及辅因子互作等局限，因此不能替代实验验证。研究结论部分翻译如下：本研究分析了11例携带TUBA1A、TUBB2A、TUBB4A和TUBGCP6变异的患者；GDD是一致特征（11/11，100%），而癫痫和结构性脑畸形呈可变外显和显著表型多样性（分别见于81.8%和63.6%，超过三分之一患者脑MRI正常）。分子层面，计算机建模提示这些错义替换可能影响蛋白质稳定性和构象，从而在理论上扰动微管动力学，但该前提需未来严格实验验证。新发现的TUBA1A P175L和TUBB4A G10S等位点扩展了基因型-表型谱。研究局限包括队列规模有限且每个新变异仅见于单一先证者，不能就严格基因型-表型相关作出确定结论；临床和神经影像表现反映观察到的个体表型而非普遍适用的变异特异性特征；计算机结构见解仅来自AlphaFold3和FoldX预测，不构成微管动力学、轴突运输或神经元迁移受损的直接生物学证据。需更大规模多中心国际注册研究及互补功能验证，包括微管网络活细胞成像、患者来源诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）神经元模型和体内动物实验，以明确致病机制并验证变异特异性表型后果。
