《Journal of Dairy Science》：Effect of conditions and diseases associated with systemic inflammation on the plasma concentration of growth differentiation factor 15 (GDF15) in dairy cows
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摘要：研究人员分析了奶牛在围产期、经内毒素脂多糖（LPS）处理后、热应激期间以及存在感染性疾病时血浆生长分化因子15（GDF15）的变化。与这些状况相关的事件包括全身性炎症和食欲下降。鉴于GDF15最初是在活化免疫细胞系中被发现的一种过表达cDN
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摘要：研究人员分析了奶牛在围产期、经内毒素脂多糖（LPS）处理后、热应激期间以及存在感染性疾病时血浆生长分化因子15（GDF15）的变化。与这些状况相关的事件包括全身性炎症和食欲下降。鉴于GDF15最初是在活化免疫细胞系中被发现的一种过表达cDNA，且其已被证实是一种厌食信号，因此GDF15可能与上述状况相关。对泌乳早期奶牛静脉注射LPS后，血浆GDF15从基线浓度45.2 ± 7.7 pg/mL升至给药后3小时内的峰值浓度511.1 ± 92.2 pg/mL，并在33小时后恢复至基线浓度。LPS给药后最初24小时内的干物质采食量与血浆GDF15曲线下面积呈负相关。LPS使肝脏GDF15表达升高6倍，但对全血离体添加LPS后的GDF15浓度无影响，这表明肝脏而非循环免疫细胞是GDF15的来源。在奶牛后备牛中，乳腺实质和子宫的GDF15表达水平与肝脏相当，提示这些组织具备响应局部内毒素而增加GDF15产生的能力。为支持这一假说，对泌乳早期奶牛进行乳腺内LPS给药后，血浆GDF15从基线浓度46.1 ± 4.1 pg/mL升至9小时后的峰值189.3 ± 30.0 pg/mL，随后在接下来15小时内降至基线水平。乳腺内LPS使肝脏GDF15表达升高2.1倍，使乳腺GDF15表达升高9.3倍。研究人员进一步探究了自然发生的内毒素暴露事件（如围产期、热应激和感染性疾病）是否会使血浆GDF15升高。在无临床疾病的奶牛中，血浆GDF15在妊娠最后3周内从32.6 ± 5.7 pg/mL逐渐升高，至分娩当日达到峰值96.5 ± 22.8 pg/mL；产后第3天血浆GDF15恢复至基线水平，并在随后18天的泌乳期内维持该水平。研究人员在7天时间内测定了以下三组奶牛的血浆GDF15：热中性条件下自由采食的奶牛、热应激条件下自由采食的奶牛，以及热中性条件下按热应激奶牛采食量进行配对饲喂的奶牛。配对饲喂和热应激奶牛因采食量减少而出现随时间依赖的血浆GDF15升高，但热应激本身无额外效应。最后，研究人员测定了保持健康或被诊断为胎衣不下、子宫炎或乳腺炎的泌乳早期奶牛的血浆GDF15。与健康奶牛相比，患子宫炎和乳腺炎的奶牛血浆GDF15浓度分别高出1.7倍和2.7倍，而胎衣不下奶牛与健康奶牛无差异。综上所述，这些数据表明与内毒素存在相关的状况会上调GDF15的产生，并提示GDF15可能是一个高度冗余系统中用于在全身性炎症期间降低食欲的成员之一。
解读性摘要：多种状况和疾病会触发全身性炎症并对采食量产生负面影响。研究人员检验了以下假说：由内毒素脂多糖给药、热应激以及乳腺和子宫细菌感染引起的全身性炎症是否会增加食欲抑制激素GDF15的产生。除热应激外，上述因素均使血浆GDF15升高，提示GDF15可能对受影响的泌乳奶牛采食量下降有所贡献。
论文解读文章
一、研究背景与目的
奶牛从妊娠后期到泌乳早期的围产期阶段，伴随着免疫系统活性的显著增强。这种免疫激活在组织重塑（如脂肪组织脂质输出、子宫复旧）中发挥必要的稳态功能，但当其全身性发生时也可能产生不利影响。全身性免疫激活可由血浆游离脂肪酸升高，或内毒素及其他促炎蛋白进入血管系统而触发。促炎蛋白进入血管的途径包括：日粮改变或热相关缺血导致的肠道通透性增加，以及乳腺或子宫细菌感染导致的血-组织屏障完整性受损。内毒素进入循环后，会触发细胞因子和急性期蛋白的产生，其中许多具有抑制食欲的能力。因此，采食量下降是经历全身性炎症相关状况和疾病的奶牛的常见表现。
生长分化因子15（GDF15）是一种新型激素，最初被鉴定为活化的人骨髓单核细胞系U937中富集的cDNA。根据其结构特征，GDF15被归类为TGF-β超家族的远亲成员。GDF15可由肝脏、肾脏和肠道等组织以及分离的非免疫细胞（肝细胞、肠细胞和肾细胞）响应线粒体功能障碍、氧化应激和内质网应激等细胞应激而产生；值得注意的是，炎症恰好可以触发同样一组细胞应激。GDF15通过脑干中表达的膜蛋白GDNF家族受体α样（GFRAL）激活参与食欲抑制的脑区。GDF15的食欲抑制作用已在部分晚期癌症恶病质患者和妊娠剧吐女性中得到证实，外源性GDF15给药可降低啮齿动物和灵长类动物的自主采食量。
研究人员此前已报道，经历慢性高胰岛素正血糖、游离脂肪酸升高和临床酮病等代谢紊乱的奶牛血浆GDF15升高。采食量下降是经历这些代谢紊乱的奶牛与经历全身性炎症相关状况和疾病的奶牛的共有特征。因此，研究人员的目的是检验以下假说：全身性炎症可能是奶牛血浆GDF15升高的第二个因素。研究人员通过测定接受静脉或乳腺内脂多糖（LPS）给药以及经历热应激、乳腺炎和子宫炎的奶牛的血浆GDF15和组织GDF15 mRNA丰度来检验这一假说。
二、主要技术方法
研究人员从多个来源获取血浆和组织样本：康奈尔大学、密歇根州立大学、爱荷华州立大学以及明尼苏达州一个商业化奶牛场的荷斯坦奶牛试验，所有研究均经当地机构动物护理和使用委员会批准。血浆GDF15采用经验证的牛GDF15 ELISA试剂盒（Ansh Labs）测定，分析灵敏度为0.42 pg/mL，批内和批间变异系数分别<5%和<8%。血浆TNF-α采用基于微球的牛细胞因子多重检测法测定。基因表达分析采用TaqMan法和SYBR Green法进行实时定量PCR，以RPS2、RPS9、EIF3K或18S作为内参基因。涉及的具体研究包括：静脉LPS给药试验（泌乳早期奶牛，n=6/组）、肝脏活检试验（泌乳中期奶牛，n=4/组）、全血离体LPS孵育试验（n=10）、乳腺内LPS给药试验（n=8）、组织表达谱调查（4头后备牛，18种组织）、围产期血浆GDF15动态分析（n=10）、热应激试验（每组n=6）、胎衣不下关联分析（康奈尔队列，n=235中筛选）、以及子宫炎和乳腺炎观察性研究（商业化农场，共871头奶牛）。
三、研究结果
静脉LPS给药的影响：泌乳早期奶牛接受静脉LPS推注后，血浆GDF15在3小时内从基线40.8 ± 5.0 pg/mL升至峰值511.1 ± 92.2 pg/mL，36小时后恢复至基线水平。LPS给药后最初24小时内，以基线采食量百分比表示的干物质采食量与血浆GDF15曲线下面积呈负相关。在另一项研究中，LPS使肝脏GDF15表达升高6倍，同时使其转录调节因子ATF4表达升高2.1倍、促炎细胞因子TNF表达升高10倍。全血离体孵育LPS后，TNF-α浓度升高5.8倍，但GDF15浓度无变化，表明循环免疫细胞不是LPS刺激下GDF15的显著来源，而肝脏是重要来源。
乳腺内LPS的影响：组织表达谱调查显示，GDF15在肾髓质和肾皮质中表达最高，其次为乳腺实质和子宫，再次为肝脏，在肌肉、心脏、脾脏、垂体和下丘脑中未检测到。乳腺内LPS给药后，血浆GDF15从基线46.1 ± 4.1 pg/mL升至9小时后的峰值189.3 ± 30.0 pg/mL，24小时内恢复至基线。LPS使乳腺GDF15表达升高9.3倍，使肝脏GDF15表达呈接近显著水平的升高（P=0.074），同时显著升高肝脏ATF4和触珠蛋白（HP）表达。通过RNA完整性对照实验排除了RNA降解造成乳腺GDF15表达假性升高的可能性。
自然发生的内毒素暴露的影响：在无临床疾病的围产期奶牛中，血浆GDF15在妊娠最后3周从32.6 ± 5.7 pg/mL逐渐升高至分娩当日的峰值96.5 ± 22.8 pg/mL，产后第3天恢复至基线水平并维持至产后21天。在热应激试验中，采食量减少导致血浆GDF15出现时间依赖性升高（DMI×Time交互，P=0.014），但热应激本身无额外效应。在疾病关联分析中，患子宫炎和乳腺炎的奶牛血浆GDF15分别比健康奶牛高1.7倍和2.7倍，而胎衣不下奶牛与健康奶牛无显著差异。在患子宫炎或乳腺炎的奶牛中，以反刍时间作为采食量指标，未检测到与血浆GDF15的相关性。
四、讨论与结论
研究人员首先通过LPS无菌炎症模型证实循环内毒素可触发GDF15产生，静脉LPS使血浆GDF15在3小时内升高11.3倍。离体全血实验和单细胞转录组学数据均不支持循环免疫细胞作为LPS刺激下GDF15的来源。肝脏被确定为静脉LPS后血浆GDF15升高的贡献组织，LPS使肝脏GDF15表达升高5.3倍，并伴随其主要转录激活因子ATF4的上调。肾脏因基础表达水平最高，也被认为可能是LPS处理奶牛GDF15的来源之一。
乳腺内LPS试验表明，局部内毒素 influx 也可升高血浆GDF15，但峰值更小（189 vs. 511 pg/mL）且更延迟（9 vs. 3小时）。肝脏和乳腺均被确定为可能的产生部位，乳腺GDF15表达升高9.3倍，且RNA降解对照实验表明该结果可能仍被低估约25%。
在自然发生的事件中，乳腺炎和子宫炎均使血浆GDF15升高，但其来源和主要触发因素尚不清楚。围产期奶牛血浆GDF15在分娩时达峰后迅速回落，这一模式与灵长类动物胎盘大量产生GDF15的情况不同，提示牛胎盘GDF15产生量可忽略不计，或升高源于子宫、乳腺和肝脏的产前相关过程。热应激试验中，采食量减少而非热应激本身驱动了血浆GDF15升高，与这些条件下肠道通透性增加的报道一致。
关于GDF15升高的功能意义，研究人员提出两种可能：其一，GDF15可能参与感染期间降低食欲的适应性反应，但LPS处理的野生型和GDF15基因敲除小鼠表现出相同程度的厌食，且疾病奶牛中未检测到GDF15与反刍时间的相关性，提示GDF15可能只是高度冗余的食欲抑制系统中的一员；其二，GDF15可能通过限制炎症反应来减轻组织损伤，GDF15基因敲除小鼠在LPS或四氯化碳处理后肝脏组织损伤更严重，GDF15过表达小鼠暴露于LPS后循环促炎细胞因子升高幅度更小，其机制可能通过脑干GFRAL受体间接介导。
研究结论：本研究数据表明，经历全身性炎症相关状况和疾病的奶牛血浆GDF15升高，并确定肝脏和乳腺为产生部位。研究局限性包括各研究间设计差异（如LPS剂量不同、采血时间不同等），以及缺乏GDF15升高影响相关生物学终点的直接证据。血浆GDF15可作为经历全身性炎症相关疾病和状况的奶牛的有用生物标志物，特别是在其具有啮齿动物中已证实的抑制食欲和炎症反应功能的情况下。未来研究需确定反刍动物在生理性血浆GDF15升高时是否发生这些反应。
