Stx2a刺激人肾小球内皮细胞产生的Fractalkine(CX3CL1)调控γδ T淋巴细胞迁移

《Frontiers in Immunology》：Fractalkine produced by Shiga toxin type 2-stimulated human glomerular endothelial cells modulates γδ T lymphocyte migration

　　

摘要
引言：γδ T细胞通过感知细胞应激的能力在组织免疫监视中发挥关键作用。然而，在Shiga毒素（Stx）诱导的肾损伤期间，其向肾脏等外周器官的募集动态仍未明确。鉴于CX3CL1/CX3CR1轴对白细胞归巢至炎症器官至关重要，研究人员探讨了其参与介导γδ T细胞向Stx损伤肾脏转运的作用。
材料：研究人员将Stx2a刺激的人肾小球内皮细胞（HGEC）体外功能实验与公共人肾损伤数据集的计算机单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析相结合。通过qPCR（quantitative PCR）、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）和流式细胞术评估CX3CL1/CX3CR1表达，并通过Transwell迁移实验定量功能性γδ T细胞募集。
结果：体外实验中，Stx2a显著上调HGEC中CX3CL1 mRNA及蛋白分泌。急性肾损伤（AKI）组织的计算机分析证实损伤实质中CX3CL1广泛上调，并鉴定出一个表达CX3CR1转录本的独特TRGV9⁺细胞簇。列联分析显示，TRGV9⁺细胞较其他T/NKT细胞更可能表达CX3CR1。重要的是，流式细胞术分析证实γδ T细胞高表达CX3CR1蛋白。最后，Transwell实验表明，Stx2a处理HGEC条件培养基和重组CX3CL1均能有效诱导γδ T细胞迁移，而破坏趋化因子梯度后该效应完全消除。
讨论：综上，这些发现提示，Stx2a刺激的内皮细胞释放CX3CL1形成趋化梯度，可能介导循环CX3CR1⁺ TRGV9/TRDV2细胞向损伤肾脏的靶向募集。

研究背景方面，溶血性尿毒综合征（HUS，hemolytic uremic syndrome）是产Shiga毒素大肠埃希菌（STEC，Shiga toxin-producing Escherichia coli）感染后出现的迟发急性症状。在阿根廷，HUS高度流行，是5岁以下儿童急性肾衰竭最常见原因、慢性肾衰竭第二位原因，也是儿童和青少年肾移植的主要原因之一。STEC产生的Shiga毒素1型和2型（Stx1、Stx2）被认为是HUS的主要毒力因子，表达Stx2的STEC是阿根廷重症HUS常见病原，Stx2a亚型导致最严重疾病。HUS临床表现包括腹泻、微血管病性溶血性贫血、血小板减少和不同程度肾损伤。出血性腹泻阶段黏膜破坏使Stx进入血流并靶向微血管表达受体的器官，主要是肾脏和中枢神经系统；肾脏因Gb₃（globotriaosylceramide，球三糖神经酰胺）受体高表达及滤过功能而最受Stx2a影响。Stx2a接触内皮细胞后激活内皮，诱导促炎状态，增加黏附分子表达及细胞因子和趋化因子分泌，促进白细胞募集。已有报道单核细胞、NK细胞和中性粒细胞参与HUS发病机制，但γδ T细胞作用了解甚少。γδ T细胞占外周血总T细胞1–10%，表达Vγ9Vδ2 T细胞受体（TCR）者是健康人主要循环γδ T细胞群；其可由细胞因子、应激诱导分子和微生物成分激活，释放IFN-γ、TNF-α、颗粒酶和穿孔素。Zanchi et al.显示NK细胞和单核细胞向肾脏募集由Fractalkine（CX3CL1）介导；CX3CL1属CX3C趋化因子家族，参与炎症细胞与内皮细胞相互作用，表面表达时作为黏附分子，胞外域切割后作为可溶性趋化因子，并可由促炎细胞因子和微生物成分上调。近期提出CX3CL1参与HUS发病，因急性期可见CX3CR1⁺循环单核细胞耗竭并与肾衰竭严重程度相关，且肾小球中存在表达CX3CR1的单核细胞和NK细胞；CX3CL1–CX3CR1轴在急慢性肾病中具致病作用。鉴于γδ T淋巴细胞可浸润组织，可能通过表达CX3CL1受体CX3CR1被主动募集至损伤肾脏。研究人员先前证明Stx2a刺激HGEC释放的可溶性因子诱导γδ T细胞向Th1样表型分化，TNF-α为关键因子，阻断TNF-α可消除γδ T细胞活化和分化。本研究旨在评估Stx2a刺激HGEC条件培养基是否调节γδ T细胞运动，并分析CX3CL1在该过程中的贡献，以拓展对HUS发展过程中γδ T细胞募集调控的认识。当前问题在于γδ T细胞在Stx诱导肾损伤中的募集动态未明，是否由CX3CL1/CX3CR1轴介导缺乏证据，且AKI公共数据中稀有γδ T细胞检测受限。研究人员整合体外Stx2a-HGEC功能实验与公共人肾损伤scRNA-seq分析，检验CX3CL1/CX3CR1介导γδ T细胞迁移。结论显示Stx2a上调HGEC CX3CL1 mRNA和分泌；损伤肾脏转录组显示CX3CL1上调及表达CX3CR1的TRGV9⁺细胞富集；γδ T细胞高表达CX3CR1并向CX3CL1迁移，破坏梯度可消除迁移。其意义在于提示CX3CL1趋化梯度可能介导循环CX3CR1⁺ TRGV9/TRDV2细胞向损伤肾脏靶向募集，为理解HUS早期事件及治疗靶点提供依据。

关键技术方法概括：研究人员采用Stx2a刺激的原代HGEC条件培养基与Transwell迁移实验评估γδ T细胞迁移；通过qPCR（quantitative PCR）和流式细胞术（含LEGENDplex）检测CX3CL1 mRNA及分泌，流式细胞术检测γδ T细胞CX3CR1表达。生物信息学分析公共人肾损伤scRNA-seq数据：KPMP（Kidney Precision Medicine Project）数据库中AKI与对照供者T/NKT细胞群，包括12例AKI共3,525个细胞、20例对照共604个细胞，总计32份标本4,129个细胞；并交叉参考CZ CELLxGENE平台正常外周血、肾脏和淋巴结γδ T细胞数据。原代HGEC及条件培养基来自4名独立未混合供者；迁移实验γδ T细胞来自不同供者。

研究结果：
3.1 人肾小球内皮细胞释放的可溶性因子触发γδ T细胞迁移。通过Transwell系统，研究人员发现Stx2a刺激HGEC上清显著诱导γδ T细胞向下室迁移，该效应在分析样本中一致；所用Stx2a浓度不诱导γδ T细胞活化。qPCR显示Stx2a刺激HGEC后CX3CL1 mRNA较未处理细胞增加，流式检测条件培养基显示CX3CL1分泌增加。结论为Stx2a刺激HGEC释放可溶性因子并上调CX3CL1，促进γδ T细胞迁移。
3.2 损伤肾脏中γδ T细胞的生物信息学分析。通过分析KPMP数据库AKI与对照供者T/NKT细胞scRNA-seq，AKI与对照整体转录空间大量重叠，无清晰分离；TRGV9表达见于28/3,525个AKI细胞（0.79%），对照0/604个细胞；TRDV2仅见于2/3,525个AKI细胞（0.057%），对照0/604个细胞；TRGV9⁺细胞分布于7/12例AKI标本（58.3%），20例对照标本均无，标本水平与AKI状态相关（Fisher精确检验，p=2.35×10^-4）。因阳性细胞频率极低，作者将其解释为探索性TRGV9/TRDV2相关转录特征，而非Vγ9Vδ2 T细胞群的确定性鉴定或扩增。交叉参考CZ CELLxGENE显示，外周血以TRDV2和TRGV9占优，淋巴结TRDV1、TRDV2和TRGV9较均衡，黏膜屏障和肝脏等实体组织以TRDV1占优；肾脏γδ T细胞绝对数较小（约1,700），TRDV1、TRDV2和TRGV9平均表达高且在大比例标注γδ T细胞中检出，TRDV3表达边缘。CX3CR1表达定位免疫细胞群，包括表达TRGV9的细胞；CX3CL1主要定位于非免疫肾细胞群，并在AKI较参考组织增加。AKI T/NKT中28个TRGV9⁺细胞有10个（35.7%）共表达CX3CR1，而4,101个TRGV9^-细胞中349个（8.5%）共表达，细胞水平比值比为5.96（Fisher精确检验，p=6.86×10^-5）；因同标本细胞非独立生物学重复，作者视为探索性分析，未作患者水平推断。结论为转录组数据与AKI中罕见TRGV9相关T细胞群富集CX3CR1一致，支持其对CX3CL1反应性的生物学合理性，但不确立因果或配对Vγ9Vδ2 TCR身份。
3.3 Fractalkine调节γδ T细胞迁移。流式细胞术显示γδ T淋巴细胞在CD3⁺淋巴细胞中CX3CR1表达最高，与CD3^- CD16⁺细胞相似，单核细胞表达最高。Transwell实验显示γδ T细胞向CX3CL1迁移；上室加入高浓度重组CX3CL1破坏梯度后，HGEC上清诱导的γδ T细胞迁移被消除。结论为CX3CL1促进γδ T细胞迁移，破坏趋化梯度可消除该效应。

讨论部分总结：HUS中肾脏最受累，因肾小球内皮细胞高表达Gb₃且肾脏滤过功能使其暴露于血中Stx；Stx接触内皮促进炎症微环境并招募免疫细胞。单核细胞和NK细胞在HUS中的作用已有证据，但γδ T细胞参与尚不明确，仅有牛等反刍动物研究报道。研究人员先前证明Stx2a处理HGEC条件培养基可使γδ T细胞增加IFN-γ、TNF-α和CD107a表达，并降低胞内穿孔素，TNF-α在该过程中关键。本研究进一步证明HGEC分泌的可溶性因子诱导γδ T细胞迁移，Stx2a刺激后CX3CL1基因转录和蛋白表达增加，与Zanchi et al.报道一致；所用毒素浓度0.01 ng/ml低于既往3.5 ng/ml达350倍，作者认为该条件可能模拟HUS早期低毒素暴露，此时毒素不引起明显内皮细胞毒性但可促进免疫细胞募集。作者指出，虽然qPCR和蛋白检测确认CX3CL1分泌增加且迁移实验证明其功能活性，但未在条件培养基系统中进行阻断实验，因此CX3CL1驱动上清诱导反应仍属推断性解释，需未来机制研究。CX3CL1–CX3CR1轴因配体/受体配对独特，避免与其他配体相互作用，是具吸引力的治疗靶点。公共AKI数据分析为探索性，KPMP与CZ CELLxGENE的差异可能反映技术差异：KPMP主要采用全组织测序，常缺乏检测稀有免疫群体的敏感性并易发生TCR链转录本丢失；CZ CELLxGENE中许多数据集采用全细胞scRNA-seq并常经CD45⁺富集，提高TRGV9/TRDV2等稀疏循环亚群分辨率。肾脏密集血管网络可捕获循环细胞并在炎症时增加，且该γδ T细胞亚群并非其他稳态器官主要组织驻留群体，提示肾脏存在特定微环境主动促进循环Vγ9Vδ2 T细胞选择性募集或滞留；局部CX3CL1释放可能建立趋化梯度，为循环γδ T细胞向损伤肾脏主动募集提供潜在受体–配体机制。

研究结论翻译：综上所述，研究人员的数据可能有助于理解HUS发生发展过程中的早期事件。值得注意的是，在STEC感染后早期阶段作出的治疗决策可能预防与Stx血液播散相关的肾脏并发症，并改善患者的生活质量。