《Frontiers in Parasitology》：Proteomics analysis of excretory-secretory proteins in mixed-sex adult stage Toxocara canis
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引言： 犬弓首蛔虫（Toxocara canis）是一种广泛流行的人兽共患线虫，可导致人类和动物罹患弓首蛔虫病（toxocariasis）。为深入理解寄生虫持久寄生与宿主互作的分子机制，本研究首次对成虫期犬弓首蛔虫的排泄分泌产物（excretory-sec
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引言： 犬弓首蛔虫（Toxocara canis）是一种广泛流行的人兽共患线虫，可导致人类和动物罹患弓首蛔虫病（toxocariasis）。为深入理解寄生虫持久寄生与宿主互作的分子机制，本研究首次对成虫期犬弓首蛔虫的排泄分泌产物（excretory-secretory products, ESPs）进行了全面的蛋白质组学表征。
方法： 研究人员从混合性别成虫中收集ESPs，并采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。
结果： 共鉴定到468种蛋白质。分泌组以高丰度的犬弓首蛔虫排泄分泌抗原-26（TES-26）磷脂酰乙醇胺结合蛋白、C型凝集素（Collectin-12）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）为主，上述蛋白共占34种ESP，占检测总蛋白的49.3%。功能富集分析揭示了经典分泌信号肽的显著存在，以及与外泌体（exosome）通路相关的蛋白，提示该寄生虫利用了非经典分泌机制。针对系统发育相关的（Clade III）线虫猪蛔虫（Ascaris suum）和亲缘关系较远的（Clade V）锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum）的比较直系同源分析表明，物种特异性ESP显著富集，同时存在一小部分跨物种高度保守的ESP。
讨论： 上述发现建立了基础性的蛋白质组学框架，增进了对犬弓首蛔虫生物学特性的理解，并鉴定出可用于高特异性诊断和理性疫苗开发的候选靶点。
论文解读
一、研究背景与科学问题
弓首蛔虫属（Toxocara）包含犬弓首蛔虫（Toxocara canis）和猫弓首蛔虫（Toxocara cati），是重要的人兽共患病原体，在全球热带和亚热带地区（如欧洲、亚洲、非洲、南美洲和北美洲）构成显著公共卫生风险，血清阳性率为5%至15%。弓首蛔虫病主要通过摄入被弓首蛔虫属虫卵污染的生的蔬菜、食物、水、沙土和土壤传播，全球范围内21%的土壤样本被鉴定为受污染。成虫阶段寄生于宿主（包括狗和猫等家养动物）肠道内，每天随粪便排出多达20万枚虫卵，促进向人类的传播。人类因意外摄入感染动物粪便中排出的含胚虫卵而感染。虫卵在小肠内孵化，幼虫在人体内穿越多种组织（包括肺、肝、眼、脑和肌肉）并逃避免疫系统，引起内脏幼虫移行症（visceral larva migrans, VLM）、眼幼虫移行症（ocular larva migrans, OLM）和神经弓首蛔虫病等严重健康问题。
全球估计有14亿人感染或暴露于弓首蛔虫，导致约91,714个伤残调整生命年（disability-adjusted life years, DALYs）损失，年度经济成本约25亿美元。然而，人类诊断依赖于基于抗原的检测方法，现有方法与其他寄生蠕虫感染（尤其是蛔虫病、粪类圆线虫病等）的抗原存在交叉反应，导致难以准确估算实际虫荷。尽管该病重要性突出，但关于犬弓首蛔虫致病性及其逃避免疫系统并在宿主体内存活多年的宿主-寄生虫分子机制所知甚少。因此，鉴定新型高特异性候选抗原对于改进免疫诊断方法（如酶联免疫吸附试验ELISA、蛋白质印迹Western blot和聚合酶链反应PCR）至关重要。
排泄分泌产物（ESPs）是蠕虫寄生虫主动产生并释放的产物，包括蛋白质、蛋白酶、脂质、糖蛋白、细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）及其他生物活性分子。ESPs在寄生虫生存中发挥关键作用，参与组织穿透、免疫逃逸、营养吸收、调节和逃避宿主免疫应答等过程。近年来，蛋白质组学已成为研究寄生虫分泌组及其与宿主和免疫系统复杂相互作用的重要技术。通过研究犬弓首蛔虫不同发育阶段的蛋白质组，研究人员可以鉴定参与免疫调节、酶活性和宿主-寄生虫互作的关键蛋白。此前在犬弓首蛔虫幼虫提取物中发现了582种蛋白质，幼虫ESPs中发现64种；另一项近期研究仅鉴定出19种幼虫ESP蛋白。然而，长期寄生于肠道的成虫期犬弓首蛔虫ESP蛋白组成此前完全未知。本研究首次利用质谱（MS）蛋白质组学对混合性别成虫犬弓首蛔虫ESPs进行谱图分析，推进对其生物学、毒力因子和宿主体内存活能力的理解。
二、研究内容与主要结论
研究人员从华盛顿特区一家动物收容所安乐死的流浪狗肠道中收集了超过100条犬弓首蛔虫成虫（雌雄数量大致相等），经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后在含抗生素的无血清RPMI-1640培养基中过夜培养，收集并过滤培养上清获得ESPs，经3 kDa分子截留（MWCO）离心超滤浓缩，Bradford法测定蛋白浓度。采用LC-MS/MS对酶解后的肽段混合物进行分析，以犬弓首蛔虫蛋白数据库为参考，在1%假发现率（FDR）阈值下鉴定蛋白质，使用Scaffold软件验证，以归一化谱图丰度因子（NSAF）进行相对定量。同时构建了全面的蛋白注释数据库，包括基因名称、基因本体（GO）注释、InterPro结构域注释、BLAST匹配、SignalP信号肽检测和TMHMM跨膜结构域检测，并利用BlastKOALA进行KEGG功能注释。通过BLAST和OrthoFinder对犬弓首蛔虫与猪蛔虫、锡兰钩虫和秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行直系同源比较。功能富集分析采用ShinyGO和WebGestalt工具，以FDR校正P值≤0.05为显著性阈值。
三、研究结果
3.1 鉴定到468种成虫犬弓首蛔虫ESP蛋白，富集于催化和外泌体通路相关功能
研究人员通过LC-MS/MS分析，在1% FDR下鉴定到2,546种肽段匹配468种ESP蛋白，蛋白长度范围为62至8,647个氨基酸。检测到的ESP平均长度显著长于其他犬弓首蛔虫蛋白（593.6个氨基酸对比379.2个氨基酸；Welch's t检验P值=9.3×10?2?；Cohen's d效应量=0.471）。功能富集分析显示，最显著富集的GO分子功能条目为催化活性（GO:0003824；FDR校正P值=8.7×10?1?，注释到43.2%的ESP），其次为碳水化合物结合（GO:0030246；P值=1.0×10?11，5.3%的ESP）。GO细胞组分分析显示ESP显著富集于细胞外区域或细胞外空间，以及超分子聚合物结合和细胞外基质相关条目。KEGG通路富集分析鉴定出26个显著富集通路，其中外泌体通路富集最显著（P值=7.45×10?1?，69种蛋白），其次为柠檬酸循环（TCA循环）和糖酵解/糖异生通路。ESPs中26.5%含有经典分泌信号肽（对比全部蛋白的9.9%），另有62种蛋白被注释到外泌体KEGG通路但缺乏信号肽，提示存在非经典的外泌体介导分泌机制。InterPro结构域富集分析鉴定出58个显著富集结构域，最显著的是海葵K毒素（ShKT）结构域（P值=7.2×10?1?）、磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）真核结构域和C型凝集素结构域。
3.2 直系同源比较鉴定出保守和犬弓首蛔虫特异性ESP及其相关功能
研究人员通过BLAST将犬弓首蛔虫蛋白与猪蛔虫（77.0%蛋白具有直系同源）和锡兰钩虫（60.1%蛋白具有直系同源）进行比较。在468种检测到的犬弓首蛔虫ESP中，331种（70.7%）为犬弓首蛔虫独有检测，35种ESP在三种线虫间共享，包括6种TES-26蛋白、6种转甲状腺素蛋白（transthyretin）和ABA-1（在犬弓首蛔虫和猪蛔虫中均为主要过敏原）。另有23种犬弓首蛔虫ESP仅在猪蛔虫中检测到直系同源ESP。大多数ESP仅在一个物种中检测到，仅少部分保守，反映了寄生虫在物种特异性生态位和宿主嗜性中快速适应宿主互作和生存的关键作用。最丰富的检测ESP为C型凝集素蛋白（占检测蛋白的5.2%），但许多最丰富的ESP为26 kDa分泌抗原蛋白（TES-26；前15名中7种）和Collectin-12蛋白（前10名中6种，也属于C型凝集素蛋白），以及超氧化物歧化酶（SOD）。
四、讨论与结论
这些发现建立了基础性的蛋白质组学框架，增进了对犬弓首蛔虫生物学的理解，并鉴定出可用于高特异性诊断和理性疫苗开发的有前景靶点。分泌组以高丰度的TES-26磷脂酰乙醇胺结合蛋白、C型凝集素（Collectin-12）和超氧化物歧化酶为主，这些蛋白共占34种ESP和49.3%的检测总蛋白。功能富集揭示了经典分泌信号肽的显著存在以及外泌体通路相关蛋白，表明该寄生虫利用了非经典分泌机制。比较直系同源分析显示物种特异性ESP显著富集，同时存在一小部分跨物种高度保守的ESP。上述结果为理解犬弓首蛔虫的宿主互作机制、免疫逃逸策略和长期存活能力提供了重要的蛋白质组学基础，为开发高特异性免疫诊断方法和疫苗候选靶点奠定了科学依据。
