基于TRIzol的微生物还原氧化石墨烯生物污染物高效去除方案

《RSC Advances》：Efficient removal of biological contaminants from microbially reduced graphene oxide via a TRIzol-based protocolOpen Access

　　

摘要专业翻译 石墨烯基纳米材料，尤其是氧化石墨烯（GO）和还原氧化石墨烯（rGO），因其良好的生物相容性、高比表面积和多样化的功能化修饰能力，已成为生物医学应用中颇具前景的平台。在从GO获得rGO的诸多方法中，细菌介导的还原通过细菌呼吸链向GO的酶促电子转移实现，导致含氧官能团的部分消耗和石墨烯晶格的恢复。然而，通过微生物还原获得的rGO通常残留细菌污染物，这些污染物可强烈吸附于rGO表面，并干扰体外细胞实验和光电应用。此外，高质量rGO的大规模生产需要有效消除这些生物杂质。本研究报道了一种基于TRIzol（一种广泛用于核酸和蛋白质提取的苯酚-胍盐试剂）纯化方法的高效微生物来源rGO净化新方案。该方案有效破坏细胞组分并解离大分子复合物，从而实现表面结合污染物的去除。研究人员通过物理化学方法对纯化后的rGO进行了表征，并进行了体外评估。该方案在不改变rGO结构特征（经拉曼光谱、X射线光电子能谱和场发射扫描电子显微镜验证）的前提下有效去除了细菌污染物，且纯化后的材料在100 μg mL?1浓度下处理24和48小时后，对BJ5ta成纤维细胞未表现出可检测的细胞毒性。该方法为涉及微生物还原石墨烯基纳米材料的研究提供了提高可重复性的实用策略。研究中还对该方法的实际限制因素——试剂危害性、可能的苯酚残留及试剂成本——进行了批判性讨论，将其定位为对材料纯度要求严格的应用场景中的实验室规模纯化步骤。

论文解读

一、研究背景与问题提出

石墨烯基纳米材料，特别是氧化石墨烯（graphene oxide，GO）和还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO），凭借其高比表面积、优异的导电性和可调的表面化学性质，在药物递送、生物传感和组织工程等生物医学领域受到广泛关注。在众多从GO制备rGO的方法中，微生物还原法因其条件温和、成本低廉且环境友好而备受青睐。多种微生物被证实具有还原GO的能力，包括Shewanella属、Geobacter属、大肠杆菌（E. coli）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、Gluconobacter属、Desulfuromonas属以及巴氏芽孢杆菌（Sporosarcina pasteurii）等。

然而，微生物还原法存在一个关键问题：细菌细胞及其相关生物分子（如脂多糖内毒素、蛋白质、核酸和膜碎片）会强烈吸附在石墨烯表面，形成稳定的生物分子冠（biomolecular corona），即使经过常规灭菌处理仍难以去除。这些残留污染物不仅可能改变石墨烯的理化性质，还会通过虚假的炎症激活干扰体外细胞实验的生物学响应，严重影响研究结果的可靠性。

传统的纯化策略——包括反复洗涤、差速离心、透析和去污剂处理——往往不足以有效去除这些污染物，原因在于石墨烯表面对两亲性生物分子和大分子碎片具有强亲和力。因此，开发一种能够高效去除微生物还原rGO表面生物污染物的纯化方法，是推动该类材料在生物医学领域可靠应用的关键前提。

二、研究内容与核心发现

针对上述问题，研究人员提出并验证了一种基于TRIzol试剂的rGO纯化新方案。TRIzol是一种苯酚-胍盐试剂，广泛用于核酸和蛋白质的同步提取。该方法的创新之处在于对TRIzol的“反向使用”：传统用途是从水相中回收生物分子，而本研究中目标物是保留在水相-有机相界面的石墨烯材料，污染物则被分配到周围相中而得以分离。

研究结果表明，该纯化方案能够有效去除微生物还原rGO表面的细菌污染物，且不会对石墨烯的结构特征造成可检测的改变。纯化后的rGO在100 μg mL^?1浓度下处理BJ5ta成纤维细胞24和48小时后，未表现出可检测的细胞毒性。该方法为微生物还原石墨烯基纳米材料的研究提供了一种提高可重复性的实用策略，并对其实际应用限制——包括试剂危害性、可能的苯酚残留和试剂成本——进行了批判性讨论。

三、主要技术方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：微生物还原法制备rGO（使用巴氏芽孢杆菌S. pasteurii ATCC 11859在30 °C下与GO共培养24小时）；TRIzol-氯仿相分离纯化方案（利用苯酚-胍盐试剂裂解细胞、解离生物大分子复合物，通过氯仿诱导相分离，使石墨烯材料在水相-有机相界面富集并选择性回收）；随后进行乙醇重悬和48小时透析（1 kDa膜）以去除物理吸附的TRIzol组分。表征手段包括紫外-可见光谱（UV-vis）、拉曼光谱（Raman spectroscopy）、X射线光电子能谱（XPS）和场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）；生物学评估包括再生长实验（Regrowth Assay）和细胞活力检测（CellTiter-Glo?和Calcein-AM双检测法）。

四、研究结果

微生物还原GO的表征。 经巴氏芽孢杆菌处理24小时后，GO悬浮液由棕色变为黑色，表明rGO的形成。未经纯化的样品UV-vis光谱在260和280 nm处呈现特征吸收峰，分别对应核酸和蛋白质；FE-SEM图像显示细菌细胞黏附于石墨烯片表面，证实了生物污染物的存在。

TRIzol纯化方案的有效性。 经TRIzol处理后，石墨烯材料在水相-有机相界面形成清晰的环状层，实现了与可溶性生物组分的物理分离。拉曼光谱显示，纯化后rGO的D带和G带清晰可辨，I_D/I_G比值从GO的0.86增至rGO的1.03，与文献报道的微生物还原GO一致。XPS分析表明，未经透析的TRIzol处理样品中N/C原子比显著升高（0.34），归因于TRIzol胍盐组分的吸附；经48小时透析后，N/C比值降至0.068，表明透析是去除TRIzol残留的关键步骤。纯化后rGO的C 1s谱显示含氧官能团显著减少，特别是基面上的环氧基团，并出现与π电子共轭恢复相关的组分。

细菌活力评估。 再生长实验显示，经TRIzol纯化后的rGO样品在新鲜培养基中未检测到细菌再生长，证实该方案可有效消除活菌。

细胞毒性评估。 采用CellTiter-Glo和Calcein-AM两种独立检测法，在24和48小时两个时间点评估了纯化后GO和rGO（100 μg mL^?1）对BJ5ta成纤维细胞活力的影响。结果显示，与未处理对照组相比，处理组细胞代谢活性无显著降低；Calcein-AM染色图像显示处理组细胞呈现密集均匀的绿色荧光，与对照组相当，证实纯化后的材料无可检测的细胞毒性。

五、讨论与结论

讨论部分指出，TRIzol处理未对石墨烯造成明显结构损伤：TRIzol组分非氧化性试剂，室温短时间处理不会引起sp2碳晶格的共价修饰；苯酚和胍盐主要通过非共价相互作用（静电、氢键和π-π）与石墨烯表面结合，这些相互作用是可逆的。FE-SEM图像显示纯化后石墨烯片保持完整，未出现明显碎裂。

关于苯酚残留问题，方案设计了多重保障措施：从界面而非酚-rich有机相回收材料、乙醇洗涤（苯酚在乙醇中自由溶解）、48小时透析（1 kDa膜对苯酚94 Da和硫氰酸胍118 Da自由渗透）。XPS证实透析后胍盐和异硫氰酸酯组分消失。虽然未直接定量苯酚，但细胞毒性实验表明残留苯酚低于细胞毒性水平。对于严格要求纯度的应用，建议通过监测透析液在270 nm处的吸光度或采用GC-MS、热重分析等方法验证。

关于成本和可扩展性，当前方案纯化0.1 mg材料约需1 mL TRIzol和0.2 mL氯仿，即每毫克材料需10 mL TRIzol，按当前目录价格计算，每毫克纯化rGO的试剂成本达数十欧元。该成本对实验室规模制备参考材料或生物医学级材料可以接受，但对克级或公斤级生产则过高。降低成本的可能途径包括优化试剂-材料比例、使用自制的酸性硫氰酸胍-苯酚试剂以及用毒性较低的1-溴-3-氯丙烷替代氯仿。

研究结论指出，TRIzol-based纯化策略是去除微生物还原氧化石墨烯表面生物污染物的有效方法，最终透析步骤是该方案不可或缺的组成部分。纯化后的rGO在拉曼光谱、XPS和FE-SEM检测中未显示结构改变，且无细胞毒性。该方法的局限性包括：内毒素完全去除未直接验证、残留蛋白质和核酸未独立定量、比表面积和层间堆叠变化未量化、仅在单一菌种和小规模条件下验证。总体而言，该方案为获得结构洁净、生物学可靠的微生物还原rGO提供了实用途径，对生物医学研究和石墨烯基电子器件应用均具有重要意义。