基于环糊精-金刚烷卟啉主客体相互作用抑制光敏剂聚集增强光动力治疗的研究

《RSC Advances》：Reducing photosensitizer aggregation via cyclodextrin–adamantane porphyrin host–guest interactions for enhanced photodynamic therapyOpen Access

　　

单线态氧（1O2）的产生产量直接决定了光动力治疗（PDT）的治疗效果。然而，光敏剂的聚集严重抑制了1O2的产生。在此，研究人员开发了一种基于主客体复合物的隔离策略，该策略可防止光敏剂的聚集，增强1O2的产生，并最终提升光动力杀伤性能。具体而言，研究人员合成了超小Cu2?xSe-CD纳米颗粒作为超分子负载平台，并将其负载金刚烷功能化的5-(4-羟基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉（Ada-TPP），从而获得超分子纳米光敏剂Cu2?xSe-CD-TPP。在该结构中，每个光敏剂分子被单独限制在锚定于Cu2?xSe纳米颗粒表面的环糊精单元空腔内，使材料具有优异的分散性，并有效抑制了光敏剂的聚集。这种合理的结构设计使得1O2产生产量增加了84.8%。体外和体内实验均证实，Cu2?xSe-CD-TPP在光照下可实现高效的肿瘤治疗。总之，该研究不仅提供了一种抑制光敏剂聚集的可靠策略，还开发了一种用于精准高效光动力治疗的有前景的纳米材料。

研究背景与问题

光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）是一种有效的癌症治疗方法，其通过光敏剂（photosensitizer）在光照下产生的单线态氧（singlet oxygen, ¹O₂）来杀死肿瘤细胞。因此，¹O₂的产量直接决定PDT疗效。卟啉类光敏剂是研究和临床中最常用的光敏剂之一，但其具有很强的疏水性和大的π共轭体系，导致在水性生理环境中容易发生聚集。这种聚集会使光敏剂在光照下以热能或超氧阴离子的形式耗散能量，同时显著降低¹O₂的量子产率。此外，产生的热量不足以将肿瘤组织温度升至致死水平，而生成的超氧阴离子也会被肿瘤微环境中高水平的超氧化物歧化酶迅速清除。因此，光敏剂的聚集严重损害了依赖于单线态氧的PDT疗效。为解决这一问题，现有策略包括通过化学修饰提高固有水溶性、设计响应肿瘤微环境的光敏剂以及引入空间位阻抑制分子间聚集等。但这些方法仍存在光敏剂分子空间隔离不充分、刺激响应不完全以及系统性递送过程中严重提前泄漏等局限性。因此，开发通用且有效的新策略来防止卟啉光敏剂聚集对提升PDT疗效至关重要。

研究方法概述

本研究采用的关键技术方法包括：通过NaBH₄还原硒粉后加入CuCl₂合成非化学计量比的超小Cu_2?xSe纳米颗粒；利用巯基-β-环糊精（mercapto-β-cyclodextrin, HS-β-CD）与铜离子之间的强配位作用对其进行表面功能化，构建Cu_2?xSe-CD超分子负载平台；合成金刚烷功能化的5-(4-羟基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉（Ada-TPP）作为光敏剂；通过β-CD与金刚烷之间的主客体相互作用将Ada-TPP负载到Cu_2?xSe-CD平台上，并加入金刚烷功能化聚乙二醇（Ada-PEG）以增强分散性和生物相容性，最终制得超分子纳米光敏剂Cu_2?xSe-CD-TPP。

研究结果

2.1 超小超分子负载纳米平台（Cu_2?xSe-CD）的构建

研究人员通过两步法成功制备了Cu_2?xSe-CD。X射线衍射（XRD）图谱显示合成的Cu_2?xSe与标准卡片（PDF No. 06-0680）吻合良好。透射电子显微镜（TEM）图像表明Cu_2?xSe纳米颗粒的平均核心尺寸约为2–3 nm。热重分析（TGA）结果显示，Cu_2?xSe-CD在200–400°C范围内的失重明显高于未改性的Cu_2?xSe，这归因于HS-β-CD的热分解，证实了HS-β-CD的成功接枝。动态光散射（DLS）和Zeta电位的变化也进一步验证了这一结论。

2.2 超小超分子纳米光敏剂（Cu_2?xSe-CD-TPP）的制备

研究人员合成了Ada-TPP，其¹H核磁共振（NMR）谱图显示了苯基卟啉基团和金刚烷的特征峰，积分比为1:1，确认了其成功合成。通过¹H NMR发现，混合HS-CD与Ada-TPP后，金刚烷质子信号发生明显的化学位移扰动，表明金刚烷基团插入环糊精空腔。荧光滴定实验显示，随着HS-CD浓度增加，Ada-TPP的荧光强度呈浓度依赖性增强，通过非线性回归拟合得到结合常数K_a = (2.48 ± 0.27) × 10⁵ M^?1，证实了HS-CD与Ada-TPP之间的高效主客体相互作用。随后，将Ada-TPP负载到Cu_2?xSe-CD上，TGA结果显示Cu_2?xSe-CD-TPP的总有机失重比Cu_2?xSe-CD-PEG增加了9.84%，证实Ada-TPP成功负载。DLS和Zeta电位测量显示Cu_2?xSe-CD-TPP具有良好的稳定性。TEM图像显示其粒径为4–6 nm。通过Soret带吸光度标准曲线测得Ada-TPP的负载含量为10.39 ± 0.42 wt%。

2.3 Cu_2?xSe-CD-TPP中Ada-TPP聚集状态的评估

光谱实验结果表明，游离的Ada-TPP和OH-TPP在水中表现出明显的Soret带展宽和吸光度下降，以及严重的荧光猝灭，表明它们在水中的严重聚集。相比之下，通过主客体组装获得的Cu_2?xSe-CD-TPP则显示出清晰尖锐的Soret带和强烈的荧光发射，证明HS-CD与Ada-TPP的主客体复合有效缓解了卟啉聚集。时间分辨荧光衰减和绝对荧光量子产率测量进一步证实，游离Ada-TPP的量子产率为6.5%，而Cu_2?xSe-CD-TPP的量子产率高达19.3%，荧光寿命也从3.20 ns延长至4.2 ns，表明主客体相互作用抑制了由卟啉分子间聚集引起的非辐射衰变途径。

2.4 Cu_2?xSe-CD-TPP的活性氧（ROS）生成和光声成像能力评估

通过1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）降解实验评估单线态氧（¹O₂）生成能力。结果显示，空白光照组和Cu_2?xSe-CD+光照组几乎没有DPBF降解，而Ada-TPP和Cu_2?xSe-CD-TPP组在光照下均表现出显著的DPBF降解。Cu_2?xSe-CD-TPP组的降解动力学明显快于Ada-TPP组，通过比较斜率计算得出，Cu_2?xSe-CD-TPP的¹O₂产率相比游离光敏剂提高了84.8%。此外，光声成像（PAI）实验表明，Cu_2?xSe-CD-TPP在808 nm激光照射下的PA信号随浓度增加而增强，且呈良好的线性关系，可作为有效的PA成像造影剂。

2.5 Cu_2?xSe-CD-TPP的细胞杀伤性能评估

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到4T1细胞对Cu_2?xSe-CD-TPP的内吞呈时间依赖性。细胞内ROS检测显示，Cu_2?xSe-CD-TPP加光照组产生了比Ada-TPP加光照组更强的绿色荧光，表明其产生了更高水平的ROS。MTT实验结果表明，在黑暗条件下，两种材料在高达5.0 μg mL^?1的卟啉浓度下细胞存活率均超过90%，具有良好的生物相容性。而在650 nm激光照射下，Cu_2?xSe-CD-TPP表现出比Ada-TPP更强的浓度依赖性细胞毒性，即使在低至0.16 μg mL^?1的卟啉浓度下也能显著抑制细胞生长。

2.6 Cu_2?xSe-CD-TPP的体内抗肿瘤效果评估

在4T1荷瘤小鼠模型中，肿瘤生长曲线和代表性照片显示，空白组、单纯光照组和Cu_2?xSe-CD-TPP单独处理组肿瘤快速生长。而Ada-TPP+光照和Cu_2?xSe-CD-TPP+光照处理均表现出抗肿瘤效果，其中Cu_2?xSe-CD-TPP+光照组的肿瘤抑制作用最强。离体肿瘤的重量和照片也证实了这一趋势。所有组别的小鼠体重均保持稳定，无明显下降，证明了Cu_2?xSe-CD-TPP的良好生物相容性。TUNEL染色结果显示，Cu_2?xSe-CD-TPP+光照组诱导了最高程度的肿瘤细胞凋亡。此外，激光照射下的温度升高不足以引起肿瘤消融，证实治疗效果主要源于光动力效应。

总结与结论

本研究提出了一种基于主客体复合物的隔离策略来抑制卟啉光敏剂的聚集并提高PDT疗效。研究人员从超小Cu_2?xSe纳米颗粒和巯基-β-环糊精出发，构建了Cu_2?xSe-CD超分子纳米平台，随后负载金刚烷功能化的卟啉光敏剂，获得了超小Cu_2?xSe-CD-TPP超分子纳米光敏剂，其Ada-TPP负载量约为10.39 wt%。分子HS-CD/Ada-TPP模型的荧光滴定支持主客体缔合，而纳米颗粒组装体的光谱表征与Ada-TPP的空间隔离一致，这有效防止了卟啉光敏剂的聚集。与游离光敏剂相比，Cu_2?xSe-CD-TPP的¹O₂产量增加了84.8%，并实现了高效的肿瘤细胞杀伤。此外，Cu_2?xSe-CD-TPP表现出优异的抗肿瘤性能。总体而言，该工作不仅开发了一种防止光敏剂聚集的新策略，也为高效PDT开发了一种有前景的纳米材料。