内置pH调节的新型V型碱性天然深共熔溶剂用于血浆中枢神经系统药物的磁性分散液液微萃取及GC-MS/MS分析

《Frontiers in Chemistry》：A novel type V natural deep eutectic solvent with built-in pH-regulation for magnetic dispersive liquid-liquid microextraction of central nervous system drugs in plasma samples

　　

引言：本研究提出一种基于碱性天然深共熔溶剂（alkaline natural deep eutectic solvent, ANADES）的磁性分散液液微萃取（magnetic dispersive liquid-liquid microextraction, ANADES-M-DLLME）方法，用于血浆中中枢神经系统（central nervous system, CNS）药物的便捷、绿色和高效提取。方法：一种新型无毒V型ANADES作为萃取剂，不仅可实现极性定制，而且由于其内置pH调节能力，可直接将溶液pH调节至碱性条件，从而显著提高CNS药物的提取效率。此外，无需外部pH调节，结合磁性颗粒辅助回收萃取剂，可大幅简化样品制备流程。结果：在最佳提取条件下，所建立方法结合气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry, GC-MS/MS）检测，成功应用于人血浆样品中CNS药物的提取和定量。经方法验证，该方法具有良好的线性（R² > 0.990）、高准确度（加标回收率95.1%–114.9%）和精密度（相对标准偏差（relative standard deviations, RSDs）< 13.3%）。七种目标分析物获得低检测限（limits of detection, LODs；0.61–3.36 ng/mL）和定量限（limits of quantification, LOQs；2.05–9.89 ng/mL）、满意的提取回收率（85.01%–99.89%）以及富集因子（enrichment factors, EF；6.65–8.79）。采用三种绿色分析化学（green analytical chemistry, GAC）指标对该方法进行分析，进一步证实了方法的绿色性。讨论：与已报道的分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME）技术相比，所建立的ANADES-M-DLLME方法绿色、快速、便捷且具有成本效益，为广泛的临床和生物分析应用提供了一种有前景的解决方案。

论文解读：准确监测生物体液中的中枢神经系统（central nervous system, CNS）药物对临床毒理学和治疗药物管理（therapeutic drug management, TDM）具有重要意义。CNS药物如抗抑郁药、镇静催眠药和抗精神病药常具有窄治疗窗，需精确测定血药浓度以防范过量、毒性和治疗无反应等风险。然而，生物样品基质复杂，血浆蛋白和磷脂等会干扰色谱分析，因此色谱分析前需有效样品制备。已有小型化萃取技术包括磁性固相萃取、基于中空纤维的固相微萃取和填充吸附剂微萃取等；DLLME因流程简单、富集能力高而被广泛使用，但萃取溶剂选择关键，单一溶剂难以兼顾多分析物极性差异，二元溶剂DLLME仅部分缓解该问题，且此类技术仍高度依赖挥发性、有毒有机溶剂。基于绿色分析化学原则，开发无毒、高效、低成本绿色萃取剂成为热点。深共熔溶剂（deep eutectic solvents, DESs）由氢键受体（hydrogen bond acceptor, HBA）与氢键供体（hydrogen bond donor, HBD）通过氢键形成，具有易合成和极性可定制等优势；天然深共熔溶剂（natural deep eutectic solvents, NADES）及V型DES进一步扩展了绿色萃取剂选择。但NADES基DLLME仍存在两个问题：萃取两性化合物时常需外部pH调节，增加操作复杂性和误差风险；微量萃取剂回收仍不便，现有策略如注射器装置或漂浮有机液滴固化仍较复杂。尤其，将碱引入疏水NADES形成具有内置pH调节的V型碱性NADES尚鲜见报道。因此，研究人员开发基于V型ANADES的磁性分散液液微萃取（ANADES-M-DLLME）方法，以简便高效提取生物样品中的CNS药物；其创新在于将氨引入疏水NADES构建内置碱性，并利用Fe₃O₄磁性颗粒回收NADES相，实现无需外部pH调节和快速相分离。该方法据原文称是首次将V型碱性NADES与磁性DLLME结合用于血浆中碱性CNS药物提取，意义在于为临床和生物分析提供绿色、快速、便捷且具成本效益的样品前处理方案。

关键技术方法（≤250字）：研究人员采用加热-搅拌法合成V型NADES，以menthol为HBD、eucalyptol或carvone为HBA，并将氨水引入疏水NADES制备ANADES；以Fe₃O₄磁性颗粒辅助回收萃取相；采用GC-MS/MS在selected ion monitoring（SIM）和multiple reaction monitoring（MRM）模式下检测；用单因素实验和Box–Behnken设计（Box–Behnken design, BBD）-响应面法（response surface methodology, RSM）优化；开展基质效应、线性、LOD/LOQ、回收率、精密度验证及AGREEprep、Complex MoGAPI、BAGI绿色度评价；血浆样品来源于郑州市第七人民医院。

研究结果：3.1 V型ANADES的表征：通过FTIR和¹H NMR研究分子间相互作用，FTIR显示O–H伸缩振动峰位移及指纹区峰位移，¹H NMR显示约2.5 ppm质子信号上移，结合室温形成均一透明液体，支持menthol与两种HBA间氢键作用及V型NADES形成。3.2 ANADES-M-DLLME方法的可行性研究：3.2.1 ANADES合成可行性：V型DES由中性分子经氢键形成，避免了酸性基团与氨的中和；比较氢氧化钠、氢氧化钾和氨，仅氨水形成功能性ANADES，纯NADES呈中性而ANADES在水和血浆中呈碱性，说明碱性来自引入的氨。3.2.2 ANADES-M-DLLME过程可行性：比较酸性、中性、碱性条件，碱性条件下七种分析物回收率均>80%，酸性最差；所选CNS药物为弱碱性，pK_a约8.0–10.5，pH 9.49时主要为中性去质子化形式，利于疏水分配，氢键及芳香药物的π型作用可能进一步增强萃取；Fe₃O₄可有效捕获NADES，碱性NADES 2（menthol–carvone）优于NADES 1。3.2.3 ANADES-M-DLLME方法性能：加标水样经处理后色谱峰与标准溶液对应，信号增强，空白水样无干扰峰，验证了富集可行性。3.3 ANADES-M-DLLME条件优化：3.3.1提取条件变量优化：单因素确定HBD:HBA为1:1、NADES体积、氨水体积、提取时间、磁性颗粒质量和粒径等影响，确定氨水400 μL、提取2 min、50 nm磁性颗粒等条件。3.3.2 BBD优化提取条件：17次实验考察NADES体积、磁性颗粒质量和氨水体积，模型显著（P<0.0001），失拟不显著（F=5.53，P=0.0660），R²=0.9897、调整R²=0.9765、预测R²=0.8641，精度23.60；优化条件为NADES 23 μL、氨水400 μL、提取2 min、Fe₃O₄（50 nm）12 mg，实测与预测吻合，准确度97.9%±10.5%。3.3.3解吸变量优化：确定200 μL乙酸乙酯、涡旋1.0 min可实现解吸。3.4基质效应评价：比较血浆与去离子水对照峰面积，三个浓度下基质效应为84.9%–108.0%，血浆基质影响可忽略，后续采用标准溶液验证。3.5方法验证：线性范围为5–1000 ng/mL（LID、AMP、PMZ）和10–1000 ng/mL（IMP、DZP、CMZ、CZP），R²为0.990–0.999；LOD为0.61–3.36 ng/mL，LOQ为2.05–9.89 ng/mL；提取回收率85.01%–99.89%，EF为6.65–8.79；日内和日间RSD<13.3%，相对回收率95.1%–114.9%；线性范围覆盖多数药物治疗参考范围，LLOQ低于或接近下限，高浓度LID和DZP可稀释后测定。3.6生物样品分析：采用单盲加标血浆样本（25、40、80 ng/mL）验证，七种分析物均检出，相对回收率95.1%–112.7%，RSD<15.1%，表明方法适用于生物分析。3.7方法绿色度评价：AGREEprep得分0.63，Complex MoGAPI得分86，BAGI得分67.5；乙醇和乙酸乙酯虽为挥发性有机化合物但每样品用量小，支持方法绿色性。3.8方法优势：与已报道DLLME方法比较，本方法使用绿色无毒V型NADES、萃取剂消耗低、回收率高（85.1%–99.8%）、内置pH调节和磁性回收简化流程、提取时间短，LOD为0.61–3.36 ng/mL，具绿色、快速、简便和成本效益。

讨论部分总结：研究人员所建立方法将内置碱性与磁性回收结合，消除外部pH调节和离心回收两个操作瓶颈，验证参数表明优化条件稳健并适用于常规分析；宽线性范围和低LOD显示其可用于临床CNS药物TDM，优势为绿色、快速、成本效益和灵敏。局限性包括：因真实临床样本有限，方法仅用加标血浆验证，对更广泛分析物或其他生物基质（如尿液或脑脊液）的适用性需进一步研究，未来将用更多真实患者样本验证；方法依赖GC-MS/MS，常规实验室并非普遍具备且检测成本较高，未来将适配更易获得和成本更低的仪器。总体而言，该方法在绿色、成本效益和简化方面具竞争优势，在临床TDM中具潜力。

研究结论翻译：研究人员开发了一种利用V型碱性NADES结合磁性颗粒辅助萃取剂回收的新型高效DLLME方法，用于生物体液中CNS药物测定。与需要外部pH调节和离心回收萃取剂的常规NADES基DLLME方法不同，所提出的ANADES-M-DLLME方法将pH调节整合到萃取剂本身并采用磁性回收，从而消除两个主要操作瓶颈。这种内置碱性和磁性回收的双重创新尚未见用于NADES基DLLME的报道。令人满意的验证参数证实优化条件稳健，适用于常规分析。宽线性范围和低LOD表明该方法足够灵敏，可用于临床环境中CNS药物的TDM。所提方法具有绿色（无毒NADES和最少溶剂消耗）、快速（短提取时间）、成本效益和灵敏等优势。然而，也应承认若干局限性。首先，由于真实临床样本有限，方法用加标血浆样本验证，其对更广泛分析物或其他生物基质（如尿液或脑脊液）的适用性需进一步研究；未来将用更多真实患者样本进一步验证。其次，方法依赖GC-MS/MS仪器，常规分析实验室并非普遍具备且检测成本相对较高；未来工作将把所开发的样品制备策略适配更易获得和成本更低的 analytical instruments。总体而言，所提方法在绿色、成本效益和简化方面具有竞争优势，可准确可靠地定量生物样品中的CNS药物，在临床TDM应用中具有良好潜力。