MPC85蛋白分散体系中纤溶酶系统的热灭活动力学研究

《Journal of Dairy Science》：Thermal inactivation of the plasmin system in MPC85 dispersions

　　

摘要专业翻译 尽管纤溶酶（PL）蛋白酶系统在研究中一直受到关注，但它仍然是牛奶蛋白饮料稳定性的一个关键问题。已知PL系统酶在强烈热处理后仍能保持活性，并导致强化牛奶蛋白饮料在货架期内发生蛋白水解。本研究考察了MPC85蛋白分散体系中PL和纤溶酶原激活物（PA）的灭活动力学。研究人员使用油浴对储存在工业相关不锈钢管中的MPC85样品在83°C至121°C的温度范围内进行热处理。采用荧光底物N-琥珀酰-Ala-Phe-Lys 7-酰胺基-4-甲基香豆素测定加热后剩余的PL活性。结果表明，在MPC85分散体系中，PA比PL具有更高的热稳定性。获得的D值遵循PL在乳清蛋白存在下已知的热力学行为，提示存在一种在牛奶样品中通常不存在的轻微保护机制。此外，在高温下，PL和PG灭活的z值有所增加，提示潜在机制发生了变化。研究人员使用HPLC表征早期储存期间的蛋白水解情况，以验证热处理在防止蛋白水解方面的有效性。结果显示热处理样品中的蛋白水解减少，表明所进行的热处理能有效灭活PL活性，这与荧光底物测定所观察到的有限PL活性一致。基于本研究确立的灭活参数，研究人员建议采用92–97°C的加热温度以实现最佳的PL灭活效果。这些发现可能推动未来关于改善PL灭活和牛奶蛋白饮料蛋白水解稳定性的新型热处理条件研究。

论文解读文章

研究背景与问题提出

牛奶蛋白浓缩物（MPC）是货架稳定的高蛋白奶昔饮料中常用的蛋白质配料。既往加速储存研究表明，由MPC配料制成的蛋白分散体在储存期间表现出显著的酪蛋白水解效应。一般而言，超高温（UHT）牛奶在储存期间（如长达一年）的过度蛋白水解可能导致物理不稳定性，如沉淀和老化凝胶化。因此，MPC的蛋白水解问题对其在牛奶饮料中的应用具有重要意义。

牛奶中酶诱导酪蛋白水解的主要原因是内源性蛋白酶——纤溶酶（PL）。PL与其无活性前体纤溶酶原（PG）、纤溶酶原激活物（PA）以及若干抑制剂共同构成PL系统。该系统的活性在挤奶前的乳腺中即已存在。PL系统并非孤立存在，而是与其他乳蛋白相互作用。PL和PG与酪蛋白胶束相关，这种关联具有pH依赖性；在pH低于4.6时，PL与酪蛋白解离进入血清相。此外，在牛奶蛋白配料（尤其是酪蛋白主导的配料）中，PL系统的活性会发生改变，因为抑制性或激活组分可能在乳清/渗透物中被去除或浓缩。

除热不稳定抑制剂外，PL、PG和PA均能抵抗常规巴氏杀菌条件。因此，巴氏杀菌反而导致PL活性增加。即使是UHT处理也会留下完整的PL，需要更强烈的热处理来防止PL诱导的蛋白水解缺陷。已有研究表明，PL灭活在高温下会发生机制转变，这与β-乳球蛋白（β-LG）的变性/聚集特性相对应。大量实验证据表明，β-LG诱导灭活的机制是与PL、PG以及PA发生二硫键交换。在77°C以上，β-LG的动力学可用性似乎是限制因素。在没有乳清蛋白的情况下，这种机制转变不会发生，PL系统则更为稳定。此外，已有研究指出，酪蛋白酸盐的添加对PL的热灭活具有保护作用，以某种方式稳定其活化状态并在空间上屏蔽β-LG的攻击。在长时间加热过程中，可用的β-LG供应耗尽，灭活速率减慢。

尽管MPC作为高蛋白乳制品饮料配料的重要性，但PL及其激活物在MPC85中的热灭活参数（如D值和z值）尚未建立。文献表明酪蛋白保护PL免受灭活，而乳清蛋白则是强效抑制剂，因此无法安全假设PL系统在MPC中的灭活参数相对于牛奶是增加还是减少。本研究旨在确定与蛋白饮料工业制造相关的浓度和温度条件下，液态MPC85蛋白分散体中PL系统的热灭活参数。

研究内容与结论

本研究采用油浴对MPC85蛋白分散体（蛋白浓度6.0%，w/w，模拟高蛋白奶昔饮料模型）在83°C至121.5°C温度范围内进行热处理，加热时间从150秒到900秒不等。通过荧光底物法测定加热后PL和PA的剩余活性，计算D值、z值、灭活速率常数（k）和灭活能量（E_a）等关键热灭活参数。同时采用HPLC表征早期储存期间的蛋白水解情况，以验证热处理在防止蛋白水解方面的有效性。

研究结果显示，在MPC85分散体系中，PA比PL具有更高的热稳定性。获得的D值遵循PL在乳清蛋白存在下已知的热力学行为，提示存在一种在牛奶样品中通常不存在的轻微保护机制。此外，在高温下PL和PG灭活的z值有所增加，提示潜在机制发生了变化。HPLC结果显示热处理样品中的蛋白水解减少，表明所进行的热处理能有效灭活PL活性，与荧光底物测定所观察到的有限PL活性一致。

关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：自制MPC85粉末的制备（通过超滤/透滤浓缩新鲜巴氏杀菌脱脂牛奶并喷雾干燥）；油浴热处理系统（使用316不锈钢管封装样品，配备热电偶实时监测温度）；荧光底物酶活性测定法（使用N-琥珀酰-Ala-Phe-Lys 7-酰胺基-4-甲基香豆素定量PL和PA活性）；热灭活参数计算（基于一阶动力学模型计算D值、z值、灭活速率常数和灭活能量）；高效液相色谱（HPLC）用于表征储存期间蛋白水解程度。

研究结果

PL和PA的热灭活动力学特征：在83.0°C至121.5°C温度范围内，PL和PA的灭活均符合一阶动力学。PL的D值从83.0°C时的214秒降至121.5°C时的42秒；PA的D值从339秒降至40秒。在所有测试温度下（除121.5°C外），PL的灭活速率均快于PA，表明PA在MPC85分散体系中比PL具有更高的热稳定性。值得注意的是，在121.5°C时，PL和PA的D值趋于接近（42秒对40秒），提示在极高温度下两者的热敏感性趋于一致。

温度依赖性分析：log D值与温度的关系图显示出不同的线性区域，表明PL和PG灭活的潜在机制在不同温度区间发生变化。在高温区间，PL和PG灭活的z值增加，提示灭活机制发生转变，这与β-LG变性/聚集特性相关的已知行为一致。

热处理对蛋白水解的抑制效果：HPLC分析显示，经热处理的样品在7天加速储存后蛋白水解程度显著降低，证实所采用的热处理条件能有效灭活PL活性，从而防止储存期间的蛋白水解缺陷。

讨论与结论

研究表明，MPC85分散体系中PL的热灭活行为与牛奶中存在乳清蛋白时的已知热力学行为一致，但存在轻微的额外保护机制。在高温下z值的增加提示灭活机制发生变化。基于本研究确立的灭活参数，研究人员建议采用92–97°C的加热温度以实现最佳的PL灭活效果。这些发现为优化牛奶蛋白饮料的热处理工艺条件提供了科学依据，可能推动未来关于改善PL灭活和蛋白水解稳定性的新型热加工条件研究。