社会饲养系统对奶牛犊牛断奶前后肠道微生物组的影响

《Journal of Dairy Science》：Effects of social rearing systems on the gut microbiome of dairy calves before and after weaning

　　

社会饲养可能为奶牛犊牛提供行为学益处，但也可能增加接触包括病原体在内的多种微生物的机会。断奶前奶牛犊牛易患胃肠道疾病，目前尚不清楚社会接触如何影响奶牛犊牛断奶前后的肠道微生物组组成。本研究旨在调查社会饲养系统对荷斯坦奶牛母犊断奶前及断奶后3天粪样微生物组的影响。研究在明尼苏达大学西中央研究与推广中心乳品场（Morris, Minnesota）进行。2020年9月至11月出生的奶牛犊牛在出生时被随机分配到一种饲养系统：个体饲养（IND, n = 18）；群体饲养（GRP, n = 21）；或母牛带犊饲养（DAM, n = 15）。犊牛在63日龄断奶，随后群体饲养，并与不同处理的犊牛混群。在断奶前和断奶后3天收集粪样，进行16S rRNA短扩增子测序（V4区）。肠道微生物组序列数据使用QIIME2和R统计接口进行生态学分析。结果显示，饲养系统、断奶以及饲养系统与断奶之间的交互作用对犊牛粪样微生物组有显著影响。尽管所有处理在断奶前具有不同的粪样微生物组组成，尤其是在类群存在/不存在分析（Jaccard指数）中，与GRP和IND犊牛相比，DAM犊牛表现出最独特的微生物组和较低的α多样性。DAM犊牛富集厚壁菌门（Firmicutes），尤其在断奶前，并富集与发酵代谢和肠道成熟相关的属，如Butyricicoccus、Megasphaera、Ruminococcus、Collinsella和Sphaerochaeta。GRP和IND犊牛在断奶前富集与固体饲料采食相关的细菌，如普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）成员。所有犊牛在断奶期间微生物组均发生改变。断奶后，处理间的微生物组组成和多样性差异减少。尽管如此，DAM犊牛仍保持最独特的微生物组和独特特征，例如与IND和GRP犊牛相比，普雷沃氏菌属（Prevotella）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的富集程度较低。总之，结果表明，与母牛完全接触饲养的犊牛（因此有机会接触成年牛及其环境资源）可能影响肠道微生物组定植，并可能加速肠道成熟。然而，这些效应在断奶后变得不那么明显。结果还表明，所有处理犊牛均存在有益细菌。因此，与成年牛及其环境资源的接触似乎影响奶牛犊牛的肠道微生物组组成和成熟。然而，进一步研究，包括功能分析（散弹枪宏基因组学和宏转录组学、代谢组学、免疫性能），考虑不同断奶策略、采食量和环境样本，以及断奶后疾病挑战模型，将有助于阐明社会接触对奶牛犊牛肠道微生物组和健康的影响。
解读性总结：社会饲养可能改善奶牛犊牛福利，但其对犊牛肠道微生物组的影响仍未知。本研究调查了在个体、群体或母牛接触饲养系统（n = 54）中饲养的奶牛母犊断奶前后的粪样微生物组组成。结果表明，社会饲养与特定的粪样微生物组特征相关。断奶前，母牛带犊饲养的犊牛表现出最独特的微生物组，富集了对肠道健康和成熟有潜在益处的细菌。与母牛分离的犊牛也表现出与固体饲料采食相关细菌的富集和多样性。断奶后，社会饲养的影响不太明显，但仍可检测到，尤其是母牛带犊饲养的犊牛。

**论文解读：社会饲养系统对奶牛犊牛肠道微生物组的影响**

**研究背景与目的**
美国大多数奶牛犊牛在断奶前采用个体饲养，此举可减少动物间的病原体暴露，因为断奶前犊牛消化道疾病发病率和死亡率较高。然而，早期社会化对犊牛身体和行为发育具有诸多益处。社会接触可能影响犊牛胃肠道（GIT）的微生物定植，肠道微生物组在营养消化、短链脂肪酸产生以及免疫系统成熟中发挥重要作用。目前关于社会饲养系统如何影响断奶前后犊牛肠道微生物组的研究较少。先前报道显示，群体饲养犊牛免疫反应改善，但未分析肠道微生物组；母牛接触饲养犊牛与出生后即与母牛分离的犊牛相比，肠道微生物组组成不同。然而，犊牛间接触以及犊牛与母牛接触对断奶前后肠道微生物组的影响仍不清楚。断奶是犊牛面临的首个重大应激事件，伴随饮食和环境变化，可能导致免疫力下降。群体或成对饲养可能通过同伴效应促进固体饲料采食并缓冲应激，而母牛接触饲养的犊牛在断奶时可能因失去母牛和乳汁而承受更高应激。本研究旨在比较个体、群体以及全母牛接触饲养系统对犊牛断奶前和断奶后3天肠道微生物组多样性和组成的影响，并检验假设：断奶前不同处理间微生物组成存在差异，个体与群体饲养犊牛相似度高于母牛带犊饲养；断奶后差异减弱。

**研究设计与方法概述**
研究于2020年9月至2021年2月在美国明尼苏达大学西中央研究与推广中心（WCROC）乳品场进行，该场包括有机和低投入常规奶牛群。研究人员使用了54头2020年秋季出生的荷斯坦和杂交母犊，随机分配到3种断奶前饲养系统：个体犊牛棚（IND, n=18）、群体犊牛棚（GRP, n=21，每群6头）和母牛带犊饲养（DAM, n=15）。IND和GRP犊牛出生后12小时内与母牛分离，饲喂初乳和过渡乳，之后每日饲喂10升巴氏杀菌全乳；DAM犊牛与母牛同圈饲养，允许自由吮吸初乳和乳汁，并可接触母牛环境。所有犊牛自由采食18%粗蛋白犊牛开食料和水，DAM犊牛还可进入母牛饲槽。犊牛平均65.5（±3.8）日龄断奶，断奶后混群饲养。在断奶前和断奶后3天采集粪样。主要技术方法包括：粪样DNA提取后对16S rRNA V4区进行扩增子测序；使用QIIME2和DADA2进行序列质量控制并分配扩增子序列变体（ASV），基于Silva 138数据库注释；α多样性以丰富度、Shannon和Simpson指数衡量，采用Kruskal-Wallis及Wilcoxon检验；β多样性基于中心对数比（CLR）转换的Robust Aitchison距离、相对丰度的Bray-Curtis距离和存在/缺失的Jaccard指数，结合主坐标分析（PCoA）、相似性分析（ANOSIM）和置换多元方差分析（PERMANOVA）；差异丰度分析采用MaAsLin2，显著性阈值为调整后q值<0.1。排除断奶前使用抗生素或生病的犊牛，最终分析样本数分别为IND 15（断奶前）和16（断奶后），GRP 17和17，DAM 14和10。

**研究结果**
**Performance: Descriptive statistics（生长性能：描述性统计）**
描述性统计显示，个体饲养犊牛出生体重平均40.0 kg，断奶前平均日增重（ADG）0.95 kg/d；群体饲养犊牛出生体重38.2 kg，ADG 1.02 kg/d；母牛带犊饲养犊牛出生体重39.7 kg，ADG 1.23 kg/d。母牛带犊饲养犊牛断奶前增重最高。

**Fecal microbiome during the preweaning period（断奶前粪样微生物组）**
断奶前α多样性分析显示，三种处理间的微生物丰富度（Kruskal-Wallis, P=0.001）和Shannon多样性（P=0.005）存在显著差异，Simpson指数差异接近显著（P=0.06）。两两比较中，IND和GRP犊牛之间无α多样性差异；DAM犊牛的丰富度低于IND（P=0.008）和GRP（P=0.0003），Shannon多样性也低于GRP（P=0.0008）。β多样性分析（PERMANOVA）表明，饲养系统显著影响犊牛粪样微生物组组成（R2=27.6%, F=7.94, P=0.001），而品种及其与饲养系统的交互作用无显著影响。PCoA显示DAM犊牛样品的聚类明显区别于IND和GRP，表明DAM处理具有最独特的微生物组。DAM与IND、GRP在所有β多样性度量指标上均存在显著差异（如Robust Aitchison PERMANOVA R2=31.7%和28.0%，P=0.001）。IND与GRP之间仅在Jaccard存在/缺失分析中表现出较小但显著的差异（R2=5.3%, P=0.002），而在加权度量中无显著差异。断奶前所有犊牛粪样中厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）占比超过80%。DAM犊牛的厚壁菌门相对丰度（71.88%）高于IND（55.64%）和GRP（55.92%），拟杆菌门较低（21.9% vs 34.80%和31.97%）。差异丰度分析（MaAsLin2）未发现IND与GRP之间有显著ASV差异；而DAM犊牛与IND和GRP相比，正富集Collinsella（q<0.04）、Butyricicoccus pullicecorum（q=0.00004）和Ruminococcus torques group（q<0.0001）等与发酵代谢和肠道成熟相关的类群；IND和GRP犊牛则与普雷沃氏菌科UCG.003（q<0.0001）、双歧杆菌属（q<0.001）和Alloprevotella（q<0.04）正关联。

**Fecal microbiome during the post-weaning period（断奶后粪样微生物组）**
断奶后，PERMANOVA分析显示断奶过程对微生物组变化贡献最大（R2=36.4%, P=0.001），饲养系统贡献为9.2%（P=0.001）。在DAM犊牛中，断奶导致α多样性显著增加（丰富度P=0.003，Shannon P=0.002，Simpson P=0.05），而IND和GRP犊牛断奶前后α多样性无显著变化（P>0.1）。所有处理犊牛断奶后拟杆菌门相对丰度总体增加，厚壁菌门减少，两门仍占主导地位。DAM犊牛断奶后仍保持较高的厚壁菌门（51.9%），但拟杆菌门与IND和GRP相似（约39%）。断奶后处理间α多样性无显著差异（Kruskal-Wallis P>0.2）。β多样性分析显示，断奶后仍可根据粪样微生物组组成区分断奶前饲养处理（PERMANOVA R2=15%, F=3.62, P=0.005），DAM犊牛仍具有最独特的聚类。IND和GRP之间的差异仅在未加权Jaccard指标中显著（R2=4.4%, P=0.02），加权指标不显著。DAM犊牛与IND或GRP相比，在所有权重和非权重β多样性指标中仍显著不同（PERMANOVA P≤0.01），饲养系统解释9.6%至20.7%的组成变异。断奶后差异丰度分析显示，DAM犊牛与IND和GRP相比，正富集Eggerthellaceae（q<0.04）、Oscillospiraceae UCG.010（q<0.09）、Butyricimonas（q<0.09）、Lachnospiraceae（vs GRP, q=0.09）和Pseudoramibacter（vs IND, q=0.04）；而IND和GRP犊牛与普雷沃氏菌属（q<0.09）、粪杆菌属（q<0.09）和Blautia（q<0.09）正关联。IND犊牛还富集Succinivibrio（q=0.04）、双歧杆菌属（q=0.04）等；GRP犊牛富集Bacteroides coprophilus（q=0.09）、Anaerostipes（q=0.09）和Olsenella（q=0.09）。IND与GRP之间无显著ASV差异。

**讨论与结论**
讨论部分总结：本研究结果表明，饲养系统（尤其是母牛接触系统）和断奶显著影响犊牛断奶前后粪样微生物组组成和多样性。犊牛与犊牛之间的接触对肠道微生物组影响很小，而通过直接接触、共享空间和资源而暴露于成年牛及其粪便、唾液和饲料，可能是造成DAM犊牛独特微生物组成的主要因素。然而，饲养系统本身包含饮食和环境差异（如DAM犊牛自由吮吸生鲜乳并接触成年牛TMR），因此研究不能单独分离社会接触的作用。DAM犊牛断奶前α多样性较低，可能与其自由吮吸乳汁导致饮食相对单一有关；但其富集的产丁酸菌（如Butyricicoccus、Ruminococcus、Megasphaera）和纤维降解相关菌（如Sphaerochaeta）提示，接触成年牛可能加速肠道微生物组的成熟。IND和GRP犊牛富集的普雷沃氏菌科、双歧杆菌属等则与固体饲料摄入和新生微生物群落维持相关。断奶导致所有处理犊牛微生物组显著变化，DAM犊牛因乳汁突然中断变化最剧烈，断奶后3天内其微生物组多样性恢复到与IND和GRP相似，但仍有独特特征。这些持久差异表明母牛接触效应在断奶后至少持续3天。研究局限性包括未收集环境样本和母牛样本，无法追踪微生物来源；未进行功能分析。
结论翻译：结果表明，断奶前社会饲养系统可能影响奶牛犊牛断奶前后的肠道微生物组。在完全全天候母牛接触系统中饲养的犊牛可能形成独特的肠道微生物组，断奶前多样性较低，但富集了与成熟肠道微生物组相关的潜在有益菌。相比之下，与母牛分离的犊牛的肠道微生物组组成和多样性表现出可能更容易度过断奶期的特征。这些差异可能与每种系统固有的方面有关，例如接触成年牛的饲槽和自由采食乳汁。虽然断奶前社会饲养的影响在断奶和混群后3天变得不太明显，但母牛带犊饲养的犊牛保留了独特的微生物组特征。因此，接触成年牛及其环境资源似乎影响奶牛犊牛的肠道微生物组组成和成熟。进一步研究，包括功能分析（代谢组学、免疫性能）、宏基因组学和宏转录组学，并考虑不同断奶策略、采食量、环境样本以及断奶后疾病挑战模型，将有助于阐明社会饲养系统对奶牛犊牛肠道微生物组和健康的影响。