无介体Bacillus laccase frL103对黄曲霉毒素B1的阶段依赖性转化与底物识别：以AFQ1及Dehydro-AFQ1为中心的产品评估框架

《RSC Advances》：Substrate recognition and stage-dependent transformation of aflatoxin B1 by mediator-free Bacillus laccase frL103Open Access

　　

基于酶的黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁, AFB₁）消减通常通过母体毒素耗竭进行评估。本研究表征了重组Bacillus laccase frL103对AFB₁的阶段依赖性、无介体转化，并评估了化学、生物学和结构结果。0、30和60 h的超高效液相色谱-高分辨质谱（ultra-high-performance liquid chromatography–high-resolution mass spectrometry, UHPLC-HRMS）谱图分析获得2846个过滤特征，显示AFB₁响应在30和60 h分别降至初始值的23.8%和14.8%。m/z 329.0660处的特征在30 h升高，并在60 h降至该响应的17.7%；精确质量和串联质谱（tandem mass spectrometry, MS/MS）碎片化支持其暂定为AFQ₁（aflatoxin Q₁）。较低丰度的m/z 327.0504特征被暂定为Dehydro-AFQ₁，即一种提出的脱氢AFQ₁相关产物。60 h反应混合物在HepG2和293T细胞中产生的活力高于完整AFB₁；基于结构的预测对所提出的产物保留了端点依赖性危害信号。在分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟中，AFB₁及其提出的产物在水合、相对于T1铜中心的距离分布和结合口袋保留方面存在差异。这些发现建立了一个阶段分辨、以产物为中心的框架，用于评估酶法AFB₁转化。该方法将生物过程性能与产物演化、细胞毒性衰减和底物识别联系起来，同时指出产物确认和定量质量平衡的必要性。

黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁, AFB₁；主要由曲霉属产生，具有肝毒性、致突变性和致癌性的真菌毒素）是农产品中常见污染物，其储存持久性、对常规加工的耐受性及健康风险使其成为全球食品安全关注对象。物理和化学处理可降低污染，但可能存在去除不完全、影响产品品质或产生不良化学残留等限制，因而需要选择性和温和的消减方法。酶法转化是途径之一，其中漆酶（laccase, EC 1.10.3.2；多铜氧化酶，可氧化多种底物并将分子氧还原为水）受到关注。然而，许多漆酶系统需要氧化还原介体（redox mediator；作为氧化还原中间体扩展底物范围或提高转化效率），增加反应复杂性，并可能干扰将检测到的产物归因于酶介导转化。无外加介体的细菌漆酶因此提供简化系统。研究人员所在团队此前开发的重组Bacillus vallismortis漆酶frL103可在无外加氧化还原介体条件下转化AFB₁，但其转化产物谱随时间的变化、处理混合物的生物响应以及AFB₁和候选产物在frL103结合口袋中的动态容纳尚未充分表征。既有评价常以母体毒素耗竭为主，但母体耗竭不能揭示转化产物身份或后续命运；AFQ₁在单一端点被检出也不能确定其为反应终态。因此，研究人员开展阶段分辨、以产物为中心的研究，以连接化学谱、混合物水平生物评估和模拟配体容纳。

研究人员用纯化frL103在无介体条件下处理AFB₁，于0、30和60 h取样，以UHPLC-HRMS表征母体和候选转化相关特征；用细胞活力实验评估60 h处理混合物；用计算机毒性预测和MD模拟提供补充信息。研究结论为：AFB₁母离子响应呈阶段依赖性下降；m/z 329.0660特征暂定AFQ₁，30 h升高、60 h下降；m/z 327.0504特征暂定Dehydro-AFQ₁；60 h混合物在HepG2和293T细胞中活力高于完整AFB₁；结构预测仍显示端点依赖危害信号；MD显示AFB₁、AFQ₁和Dehydro-AFQ₁在水合、定位和口袋保留方面存在配体依赖差异。其意义在于建立阶段分辨、产品中心框架，将生物过程性能、产物演化、细胞毒性衰减和底物识别联系起来，同时指出需产物确认和定量质量平衡。

关键技术方法概括：重组Bacillus laccase frL103纯化后，在无介体条件下于0、30、60 h取样，采用UHPLC-HRMS进行非靶向特征分析；以MS-DIAL 5.0进行峰检测、解卷积和对齐，按信噪比、强度和阶段倍数变化过滤，行Z-score标准化后层次聚类进行阶段分类；依据精确质量、元素组成、质量误差、同位素模式、保留行为、加合物关系和MS/MS碎片进行暂定注释；用DILIPredictor（药物性肝损伤预测平台）和VenomPred 2.0（致突变性预测平台）进行结构毒性预测；以HepG2和293T细胞（由南京农业大学食品科技学院Yaning Shi和Renpeng Guo副教授提供）进行MTT活力检测；以Swiss-model同源建模、对接和Amber24进行100 ns MD，用CPPTRAJ分析RMSD（均方根偏差）、Rg（回转半径）、RMSF（均方根涨落）、水桥、配体-T1 Cu距离和口袋保留。

研究结果：3.1 frL103处理过程中AFB₁离子响应的阶段依赖性下降。通过提取离子色谱，质子化AFB₁（[M + H]⁺, m/z 313.0707）在约8.24 min出峰，其积分峰面积在30 h降至0 h的23.8%，60 h降至14.8%；MS/MS主要产物离子m/z 285.08和257.08与连续CO中性丢失一致，为候选AFB₁相关特征提供碎片参考。结论为测试条件下AFB₁离子响应呈阶段依赖性下降。3.2 UHPLC-HRMS特征的阶段依赖性分类。非靶向处理获得2846个符合过滤标准的特征，层次聚类按三阶段相对模式分为四簇，其中Cluster 1呈中间阶段富集（30 h高、60 h降），Cluster 2呈晚期增加（60 h最高），Cluster 3呈整体降低；20个代表特征显示AFB₁ m/z 313.0710位于降低组，与独立观察的AFB₁提取离子色谱下降一致。结论为阶段分类可用于优先化转化相关信号。3.3 AFQ₁及相关中间阶段富集特征。m/z 329.0660在30 h的提取离子色谱峰面积为10 421 138，60 h为1 844 799，即60 h为30 h的17.7%；该特征约7.36 min洗脱，早于质子化AFB₁，前体质量比AFB₁高15.9950 Da，MS/MS含m/z 311.06和283.06，分别对应H₂O和CO丢失，支持暂定注释为AFQ₁。m/z 327.0504在6.64 min检出，质量比暂定AFQ₁低2.0156 Da，与形式丢失H₂一致，依据精确质量、色谱行为、阶段丰度及MS1数据暂定注释为Dehydro-AFQ₁（C₁₇H₁₀O₇），且早于AFQ₁洗脱；提出漆酶经单电子抽提生成AFB₁自由基阳离子，进而形成AFQ₁及其他下游氧化衍生物的暂定氧化谱系。结论为AFQ₁和Dehydro-AFQ₁为暂定鉴定，需进一步确认。3.4 计算机危害预测与细胞活力响应。DILIPredictor和VenomPred 2.0结构毒性筛查显示，致突变性预测由AFB₁的85%降至AFQ₁和Dehydro-AFQ₁的82%；AFQ₁和Dehydro-AFQ₁的肝毒性相关谱与母体AFB₁大体相当，端点呈下降趋势但产物仍有危害信号；AFB₁剂量依赖性降低293T和HepG2细胞活力，60 h frL103处理混合物在匹配暴露条件下活力显著高于完整AFB₁。结论为处理混合物细胞毒性衰减，但结构预测仍显示端点依赖危害信号。3.5 MD模拟揭示frL103复合物的配体依赖性相互作用。100 ns模拟中复合物RMSD在初始弛豫后处于有限范围，AFB₁复合物偏差总体最低，AFQ₁和Dehydro-AFQ₁体系发生中等程度更大结构调节；Rg总体稳定，RMSF总体相似并存在局部高灵活区域；AFQ₁和Dehydro-AFQ₁的蛋白-配体水桥多于AFB₁；多数构象超出预设配体-T1 Cu距离参考范围；口袋保留分数为AFB₁ 1.000、AFQ₁ 0.979、Dehydro-AFQ₁ 0.813，Dehydro-AFQ₁保留降低且反应距离分布更宽，AFQ₁保持较稳定口袋保留并增强水介导相互作用。结论为AFB₁结构修饰改变配体-蛋白相互作用模式，可能影响底物容纳和产物释放。

讨论部分总结：讨论指出既往研究已确立漆酶介导AFB₁转化中AFQ₁形成，本研究进一步结合选定反应时间的化学谱、混合物水平细胞活力评估和MD分析；无介体条件降低配方复杂性。阶段依赖性特征分类可将未靶向数据中的转化相关信号按降低、中间阶段富集或晚期积累优先化，但簇基于行标准化响应和倍数变化过滤，描述相对时间模式；三个采样点不能解析最大丰度时间、形成和耗竭动力学或顺序。m/z 329.0660特征结构支持最强，AFQ₁保留黄曲霉毒素骨架和呋喃双键，需注意其浓度变化和后续路径。m/z 327.0504证据主要限于精确质量、保留行为和MS1特征，不能唯一确定结构，需标准品、分离产物、NMR等确认。毒性预测为探索性，评估单个输入结构，不代表处理混合物组成或暴露条件；细胞活力实验不能区分单个产物贡献，残余AFB₁暴露减少可能贡献活力改善。MD主要描述配体容纳和定位。应用上，60 h约14.8%残留AFB₁信号表明测试条件下去除不完全，不表示符合食品或饲料安全限量，需工艺优化、残留AFB₁和主要产物定量、质量平衡、产物特异性毒性测试及更广浓度和代表性基质验证。

研究结论翻译：无介体漆酶frL103处理产生时间依赖性AFB₁相关化学谱变化，包括母离子响应耗竭以及暂定AFQ₁在30 h富集后于60 h呈较低响应。m/z 327.0504较低丰度特征暂定为Dehydro-AFQ₁，其结构及与AFQ₁的拟议关系仍待确认。60 h反应混合物在测试条件下对HepG2和293T细胞显示低于未处理AFB₁的细胞毒性，而基于结构的预测显示端点依赖的潜在危害。MD模拟提示AFB₁、AFQ₁和Dehydro-AFQ₁可容纳于建模frL103口袋，并存在水合、定位和保留的配体依赖差异。这些结果支持通过母体耗竭、产物谱和生物响应评估酶法AFB₁消减；实际适用性仍需通过残留毒素定量、产物特异性安全评估以及在相关浓度和食品或饲料基质中的验证来确立。